Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

A difração de raios-X de comprimento de onda longa é usada para aproveitar as propriedades de dispersão anômalas de átomos de luz específicos nativamente presentes em macromoléculas. Isso ajuda a resolver o problema da fase cristalográfica e a confirmar inequivocamente a identidade e a localização de tais elementos dentro das macromoléculas. Enquanto nos primeiros dias da cristalografia macromolecular, as estruturas de novo foram resolvidas por múltiplas substituições isomorfos1, com o advento de linhas de raios-X tificável em síncrotrons, o enfeitio experimental baseado em multi-comprimento de onda e comprimento de onda única (SAD) técnicas de difração anômola (SAD) tornaram-se os métodos ^dominantes2 . Ambos os métodos têm historicamente se baseado no sinal isomorfo ou anômroo de metais pesados, que precisam ser introduzidos artificialmente nos cristais por co-cristalização ou imersão de ^cristal3. A abordagem de tentativa e erro e o resultado imprevisível podem tornar esses experimentos frustrantemente demorados. A incorporação de seleno-metionina durante a expressão ^proteica4 é uma maneira muito elegante de superar essas limitações e explorar a difração anômima em comprimentos de onda curtos, embora possa ser muito desafiador nos sistemas de expressão de proteínas eucarióticas.

MX de comprimento de onda longa é extremamente atraente para a determinação da estrutura por experimentos SAD ^nativos5,6 devido à conveniência de usar cristais diretamente de um teste de cristalização bem sucedido sem tratamento adicional. Além disso, o acesso às bordas de absorção de elementos de alta importância biológica, como cálcio, potássio, cloro, enxofre e fósforo, abre a oportunidade de identificar diretamente as posições desses elementos em macromoléculas7,8,9,10. Em média e baixa resolução, a atribuição de elementos baseados na densidade eletrônica 2Fo-Fc e no ambiente químico pode ser difícil, particularmente para elementos com número semelhante de elétrons ou íons fracamente ligados com ocupações parciais. Essas ambiguidades podem ser resolvidas coletando dados abaixo e acima da borda de absorção do elemento de interesse e interpretação da diferença anômula de fases do modelo resultante Fourier ^mapeia11,12. Localizar posições de átomos de enxofre nesses mapas também pode ajudar a construção de modelos em mapas de densidade eletrônica de baixa ^{resolução13}. As bordas de absorção desses elementos de luz são observadas em comprimentos de onda entre λ = 3 e 6 Å (ver Figura 1, topo). Este alcance de comprimento de onda tem sido muito além das capacidades de qualquer linha de feixe MX síncrotron, e a operação eficiente nesta faixa requer superar vários desafios técnicos, conforme descrito abaixo.

Beamline I23 em Diamond Light Source, Reino Unido, é um instrumento único, projetado especificamente para facilitar experimentos MX de comprimento de onda longa, incapaz em uma faixa de comprimento de onda entre λ = 1,13 e 5,9 Å (faixa de energia entre E = 2,1 e 11 keV). Operando em um ambiente de alto ^vácuo14, a absorção de ar e a dispersão são eliminadas, consequentemente aumentando a eficiência dos experimentos de difração e a relação sinal-ruído. Uma grande estação de endiçamento a vácuo inclui todos os componentes do ambiente amostral, incluindo o detector pilatus 12M semi-cilíndrico, um goniômetro de vários eixos, os sistemas de visualização e colmia on-line, bem como o equipamento sob medida para transferência e armazenamento de amostras (Figura 2). Cada equipamento foi otimizado para garantir que os dados de comprimento de onda longa de melhor qualidade possam ser coletados. O detector Pilatus 12M curvo pode coletar para ângulos de difração de 2φ = ±100°, resultando em dados de difração de alta resolução suficientemente altos mesmo em comprimentos de onda mais longos (Figura 1, inferior). Os 120 módulos detectores foram especificamente selecionados para compatibilidade de baixa energia e foram fornecidas calibrações para um modo adicional de ganho ultra-alto.

O menor limiar de detector possível é de 1,8 keV, levando a aumento de efeitos de canto e borda para energias inferiores a 3,6 keV e qualidade de dados comprometida nos comprimentos de onda mais longos, particularmente para cristais de baixa mosaico, pode ser observado. Esse efeito em combinação com a diminuição da eficiência quântica do ^detector15 precisa ser levado em consideração ao planejar um experimento. O goniômetro multiplatariculo permite a reorientação de cristais para permitir estratégias de coleta de dados que maximizem a qualidade e a força do sinal anômroo, bem como a completude dos dados anômalos coletados. A absorção de amostras é um fator limitante para os experimentos, particularmente em comprimentos de onda mais longos. As correções de absorção, implementadas em pacotes de software de processamento MX comumente ^usados16,17, estão funcionando bem para comprimentos de onda em torno de 3 Å. Comprimentos de onda mais longos exigirão correções de absorção analíticas baseadas em reconstruções tomográficas18 ou ablação a laser para remover material não difusor e cortar os cristais em formas bem ^definidas19. Este último também ajudará a reduzir o tamanho de cristais maiores, pois experimentos de difração de raios-X em comprimentos de onda mais longos são mais eficientes para cristais ^menores14. O desafio de manter amostras a temperaturas criogênicas durante a coleta de dados é abordado pelo resfriamento condutivo, já que o uso de dispositivos de fluxo aberto de gás frio não é compatível com um ambiente de vácuo. Assim, materiais termicamente condutores, como o cobre, são necessários para conectar a amostra a um criocooler do tubo de pulso. Os pinos padrão SPINE de aço inoxidável usados em toda a MX, bem como quaisquer outros suportes de amostra disponíveis comercialmente, não são adequados para mx de comprimento de onda longa no vácuo devido à sua má condutividade térmica.

Os porta-amostras (SHs) para MX no vácuo devem ser uma parte essencial da via térmica de remoção de calor (Figura 3A). Como tal, eles consistem em um corpo e pino de cobre termicamente condutores e incluem duas características importantes: uma forte base de ímã para garantir uma ligação térmica adequada à cabeça do goniômetro frio, e um suporte amostral, feito de poliímida, para minimizar a absorção de raios-X e a ^dispersão20. Esforços foram feitos para garantir que a experiência do usuário de colheita de cristais e resfriamento de flash seja quase idêntica à associada às práticas padrão de MX. Como os SHs I23 dedicados não são diretamente compatíveis com outras linhas de feixe síncrotron, um adaptador de aço inoxidável é usado para compatibilidade com as varinhas magnéticas de colheita de cristal e interfaces goniômetro existentes em outras linhas de feixe MX (Figura 3B). O adaptador também é importante para fazer uso das instalações de automação em outras linhas de vigas Diamond MX, que são baseadas em cabeças de gripper robô tipo ^ALS21 e layouts básicos estilo ^unipuck22, se a variação de amostra exigir uma pré-triagem rápida para seleção dos melhores cristais de difusão. O protocolo de preparação e carregamento da amostra pode ser dividido em duas etapas:

Estágio 1: Colheita de cristais e congelamento de flash realizados por usuários em seus próprios laboratórios

Após avaliação da adequação do projeto para coleta de dados I23, os titulares de amostras com loops que correspondem aos tamanhos de cristal (pré-montados com adaptadores) são enviados aos laboratórios de usuários para coleta de cristais. Para evitar qualquer dano, SHs e adaptadores não devem ser separados e devem ser usados como uma unidade para fins de pesca de cristais com laços de tamanho apropriado usando varinhas magnéticas padrão de colheita de cristais. Como é comum no MX, esta tarefa é realizada manualmente sob o microscópio, e os cristais são imediatamente resfriados em uma de guerra de espuma com nitrogênio ^líquido23. Devido a uma incompatibilidade de forças magnéticas, as SHs atualmente não são compatíveis com unipucks. O armazenamento e o envio são realizados por meio de combipucks (ver a Tabela de Materiais), que estão disponíveis aos usuários mediante solicitação, juntamente com as pastilhas de dry shipper compatíveis (Figura 3C). Estes discos compartilham a mesma placa base com as unipucks amplamente utilizadas e permitem uma rápida pré-triagem de amostras em outras linhas de raios Diamond MX. Emprestar este equipamento aos usuários é atualmente o melhor arranjo, até que os detentores de amostras sob medida estejam disponíveis comercialmente. O transporte para a linha de transporte requer os carregadores secos padrão usados na comunidade MX.

Estágio 2: Transferência de amostras resfriadas crio-cooled para a estação de vácuo

Uma vez que as amostras chegam na linha de luz, elas são preparadas para transferência para a estação de vácuo. Isso envolve a remoção de SHs de combipucks e a separação de adaptadores. A introdução de amostras biológicas ao vácuo é realizada rotineiramente no campo da microscopia crio-elétron. Alguns dos conceitos bem estabelecidos foram adaptados para a transferência de amostras I23. Em suma, as SHs são transferidas sob nitrogênio líquido para blocos de transferência (Figura 3D). Estes blocos possuem excelente condutividade térmica e uma massa térmica significativa, impedindo que os cristais atinjam a temperatura de transição de vidro quando no vácuo. Até quatro blocos, com capacidade de quatro amostras cada, são carregados sob nitrogênio líquido em um disco de bloco (Figura 3H), que é usado tanto para a transferência de amostras para o Sistema de Transferência Criogênica (CTS) ou para armazenamento em dewars de nitrogênio líquido entre experimentos.

O Sistema de Transferência Criogênica desenvolvido na Diamond Light Source é composto por dois sub-conjuntos, a Estação de Amostra e o Shuttle (Figura 4A). A Estação de Amostra consiste em um banho de nitrogênio líquido para armazenamento temporário de cristais proteicos e possui características específicas para garantir a segurança e permitir uma experiência fácil de usar (Figura 5). O CTS é controlado por um controlador lógico programável através de uma interface touchscreen fácil de usar. A Estação de Amostra tem diodos emissores de luz embutidos para melhor visualização e um conjunto de aquecedores controlados em close-loop para automatizar a secagem do banho de nitrogênio líquido uma vez que as amostras tenham sido transferidas. Também possui uma variedade de sensores para garantir a segurança e o funcionamento eficiente do sistema. A Estação de Amostra tem hardware sob medida para fornecer uma interface elétrica confiável para interagir com o transporte para operações, como bombear até vácuo áspero para transferência de amostras, bem como monitoramento dos níveis de nitrogênio líquido e a temperatura dentro do transporte.

O Shuttle (Figura 6) é um dispositivo portátil usado para pegar um bloco de transferência do banho de nitrogênio líquido da Estação amostra e transferi-lo dentro de um ambiente criogênico e de vácuo para a estação final. Inclui uma de guerra de nitrogênio líquido para manter as amostras frias durante a transferência, monitoramento de nível líquido na de guerra e uma variedade de sensores para operação e segurança do usuário. O braço de transferência é equipado com uma unidade magnética e inclui ranhuras usinadas para orientar os usuários em blocos de transferência de carregamento e descarga com segurança para a estação final. A transferência da nave auxiliar para o vaso de vácuo é conduzida através de uma câmara de ar. A câmara de ar é uma interface para a nave auxiliar na estação final usada para evacuar o interespaço entre a nave auxiliar e a estação final, antes de abrir as válvulas de vácuo da nave auxiliar e da estação final. As sequências de bombeamento e ventilação são totalmente automatizadas e podem ser operadas através de uma grande tela sensível ao toque com uma interface fácil de usar (Figura 4C). O protocolo atual é usado para transferir um cristal de talumatina para a estação final de vácuo para coleta de dados.