Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di campioni criogenici e il trasferimento di cristalli nella stazione finale del vuoto sulla beamline I23 a Diamond Light Source, per esperimenti di cristallografia macromolecolare a raggi X a lunga lunghezza d’onda.
La cristallografia macromolecolare a lunga lunghezza d’onda (MX) sfrutta le proprietà anomale di scattering di elementi, come zolfo, fosforo, potassio, cloro o calcio, che sono spesso presenti nativamente nelle macromolecole. Ciò consente la soluzione a struttura diretta di proteine e acidi nucleici tramite phasing sperimentale senza la necessità di ulteriori etichettature. Per eliminare il significativo assorbimento d’aria dei raggi X in questo regime di lunghezza d’onda, questi esperimenti vengono eseguiti in un ambiente di vuoto. Beamline I23 a Diamond Light Source, Regno Unito, è il primo strumento di sincrotrone del suo genere, progettato e ottimizzato per esperimenti MX nella lunga gamma di lunghezze d’onda verso 5 Å.
Per rendere ciò possibile, un grande recipiente per vuoto racchiude tutti i componenti della stazione terminale dell’ambiente campione. La necessità di mantenere i campioni a temperature criogeniche durante la conservazione e la raccolta dei dati nel vuoto richiede l’uso di portacampioni termicamente conduttivi. Ciò facilita un’efficiente rimozione del calore per garantire il raffreddamento del campione a circa 50 K. L’attuale protocollo descrive le procedure utilizzate per la preparazione dei campioni e il trasferimento dei campioni nel vuoto sulla beamline I23. Garantendo l’uniformità nelle pratiche e nei metodi già stabiliti all’interno della comunità della cristallografia macromolecolare, il raffreddamento del campione alla temperatura dell’azoto liquido può essere eseguito in qualsiasi ambiente di laboratorio dotato di strumenti MX standard.
Lo stoccaggio criogenico e il trasporto di campioni richiedono solo attrezzature standard disponibili in commercio. Sono necessarie attrezzature specializzate per il trasferimento di cristalli raffreddati criogenicamente dall’azoto liquido alla stazione terminale del vuoto. Strumenti di gestione dei campioni su misura e un sistema di trasferimento criogenico (CTS) dedicato sono stati sviluppati internamente. I dati di diffrazione raccolti su campioni preparati utilizzando questo protocollo mostrano eccellenti statistiche di fusione, indicando che la qualità dei campioni è inalterata durante la procedura. Ciò apre opportunità uniche per l’MX nel vuoto in un intervallo di lunghezze d’onda oltre le linee di fascio di sincrotrone standard.
La diffrazione a raggi X a lunga lunghezza d’onda viene utilizzata per sfruttare le proprietà di diffusione anomala di specifici atomi di luce presenti nativamente nelle macromolecole. Questo aiuta a risolvere il problema della fase cristallografica e a confermare in modo inequivocabile l’identità e la posizione di tali elementi all’interno delle macromolecole. Mentre nei primi giorni della cristallografia macromolecolare, le strutture de novo sono state risolte mediante sostituzione isomorfa multipla1, con l’avvento di linee di fascio di raggi X sintonizzabili ai sincrotroni, la fasatura sperimentale basata su tecniche di diffrazione anomala multi-lunghezza d’onda e singola lunghezza d’onda (SAD) sono diventati i metodi dominanti2 . Entrambi i metodi si sono storicamente basati sul segnale isomorfo o anomalo dei metalli pesanti, che devono essere introdotti artificialmente nei cristalli mediante co-cristallizzazione o immersione dei cristalli3. L’approccio per tentativi ed errori e l’esito imprevedibile possono rendere questi esperimenti frustranti e dispendiosi in termini di tempo. L’incorporazione della seleno-metionina durante l’espressione proteica4 è un modo molto elegante per superare queste limitazioni e sfruttare la diffrazione anomala a lunghezze d’onda corte, sebbene possa essere molto impegnativa nei sistemi di espressione proteica eucariotica.
MX a lunghezza d’onda lunga è estremamente interessante per la determinazione della struttura da esperimenti SAD nativi5,6 a causa della comodità di utilizzare cristalli direttamente da uno studio di cristallizzazione di successo senza ulteriori trattamenti. Inoltre, l’accesso ai bordi di assorbimento di elementi di elevata importanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo, apre l’opportunità di identificare direttamente le posizioni di questi elementi nelle macromolecole7,8,9,10. A media e bassa risoluzione, l’assegnazione degli elementi in base alla densità elettronica 2Fo-Fc e all’ambiente chimico può essere difficile, in particolare per elementi con un numero simile di elettroni o ioni debolmente legati con occupazioni parziali. Queste ambiguità possono essere risolte raccogliendo dati sotto e sopra il bordo di assorbimento dell’elemento di interesse e l’interpretazione della risultante differenza anomala modellata sulle mappe di Fourier11,12. Localizzare le posizioni degli atomi di zolfo in queste mappe può anche aiutare la costruzione di modelli in mappe di densità elettronica a bassa risoluzione13. I bordi di assorbimento di questi elementi leggeri sono osservati a lunghezze d’onda comprese tra λ = 3 e 6 Å (vedi Figura 1, in alto). Questa gamma di lunghezze d’onda è stata ben oltre le capacità di qualsiasi beamline MX di sincrotrone e un funzionamento efficiente in questo intervallo richiede il superamento di diverse sfide tecniche, come descritto di seguito.
Beamline I23 a Diamond Light Source, Regno Unito, è uno strumento unico, specificamente progettato per facilitare esperimenti MX a lunga lunghezza d’onda, sintonizzabile in un intervallo di lunghezze d’onda compreso tra λ = 1,13 e 5,9 Å (intervallo di energia tra E = 2,1 e 11 keV). Operando in un ambiente ad alto vuoto14, l’assorbimento d’aria e la dispersione vengono eliminati, migliorando di conseguenza l’efficienza degli esperimenti di diffrazione e il rapporto segnale-rumore. Una grande stazione terminale per vuoto racchiude tutti i componenti dell’ambiente campione, tra cui il rilevatore semicilindrico Pilatus 12M, un goniometro multiasse, i sistemi di visualizzazione e collimazione in linea, nonché le apparecchiature su misura per il trasferimento e lo stoccaggio dei campioni (Figura 2). Ogni apparecchiatura è stata ottimizzata per garantire che possano essere raccolti i dati di lunghezza d’onda lunga della migliore qualità. Il rivelatore curvo Pilatus 12M può raccogliere angoli di diffrazione di 2θ = ±100°, ottenendo dati di diffrazione sufficientemente ad alta risoluzione anche alle lunghezze d’onda più lunghe (Figura 1, in basso). I 120 moduli rivelatori sono stati specificamente selezionati per la compatibilità a basso consumo energetico e sono state fornite calibrazioni per un’ulteriore modalità di guadagno ultra-alto.
La soglia del rivelatore più bassa possibile è di 1,8 keV, portando a maggiori effetti angolari e di bordo per energie inferiori a 3,6 keV e si può osservare una qualità dei dati compromessa alle lunghezze d’onda più lunghe, in particolare per i cristalli a bassa mosaicità. Questo effetto in combinazione con la diminuzione dell’efficienza quantistica del rivelatore15 deve essere preso in considerazione quando si pianifica un esperimento. Il goniometro multiasse consente il riorientamento dei cristalli per consentire strategie di raccolta dati che massimizzano la qualità e la forza del segnale anomalo, nonché la completezza dei dati anomali raccolti. L’assorbimento del campione è un fattore limitante per gli esperimenti, in particolare alle lunghezze d’onda più lunghe. Le correzioni di assorbimento, implementate nei pacchetti software di elaborazione MX comunemente usati16,17, funzionano bene a lunghezze d’onda intorno a 3 Å. Lunghezze d’onda più lunghe richiederanno correzioni analitiche di assorbimento basate su ricostruzioni tomografiche18 o ablazione laser per rimuovere materiale non diffrattante e tagliare i cristalli in forme ben definite19. Quest’ultimo aiuterà anche a ridurre le dimensioni dei cristalli più grandi poiché gli esperimenti di diffrazione a raggi X a lunghezze d’onda più lunghe sono più efficienti per i cristalli più piccoli14. La sfida di mantenere i campioni a temperature criogeniche durante la raccolta dei dati viene affrontata dal raffreddamento conduttivo, poiché l’utilizzo di dispositivi a flusso di gas freddo a flusso aperto non è compatibile con un ambiente sottovuoto. Quindi, i materiali termicamente conduttivi, come il rame, sono necessari per collegare il campione a un criorefrigeratore a tubo a impulsi. I perni standard SPINE in acciaio inossidabile utilizzati in MX, così come qualsiasi altro supporto per campioni disponibile in commercio, non sono adatti per MX a lunghezza d’onda lunga nel vuoto a causa della loro scarsa conduttività termica.
I portacampioni (SHs) per MX sotto vuoto devono essere una parte essenziale della via termica di rimozione del calore (Figura 3A). In quanto tali, sono costituiti da un corpo e un perno in rame termicamente conduttivi e includono due caratteristiche importanti: una solida base magnetica per garantire un adeguato collegamento termico alla testa del goniometro freddo e un supporto per campioni, realizzato in poliimmide, per ridurre al minimo l’assorbimento e la dispersione dei raggi X20. Sono stati compiuti sforzi per garantire che l’esperienza utente di raccolta dei cristalli e raffreddamento flash sia quasi identica a quella associata alle pratiche MX standard. Poiché gli SH I23 dedicati non sono direttamente compatibili con altre linee di fascio di sincrotrone, viene utilizzato un adattatore in acciaio inossidabile per la compatibilità con le bacchette magnetiche per la raccolta dei cristalli e le interfacce goniometriche esistenti su altre linee di fascio MX (Figura 3B). L’adattatore è importante anche per l’utilizzo delle strutture di automazione su altre beamline Diamond MX, che si basano su teste di pinza robot di tipo ALS21 e layout di base in stile unipuck22, se la variazione del campione richiede un rapido pre-screening per la selezione dei migliori cristalli diffrattanti. Il protocollo di preparazione e caricamento del campione può essere suddiviso in due fasi:
Fase 1: Raccolta dei cristalli e congelamento flash eseguita dagli utenti nei propri laboratori
Dopo la valutazione dell’idoneità del progetto per la raccolta dei dati I23, i portacampioni con anelli corrispondenti alle dimensioni dei cristalli (pre-assemblati con adattatori) vengono inviati ai laboratori degli utenti per la raccolta dei cristalli. Per evitare danni, gli SH e gli adattatori non devono essere separati e devono essere utilizzati come un’unica unità allo scopo di pescare cristalli con anelli di dimensioni appropriate utilizzando bacchette magnetiche standard per la raccolta dei cristalli. Come è comune in MX, questa attività viene eseguita manualmente al microscopio e i cristalli vengono immediatamente raffreddati al flash in un dewar di schiuma con azoto liquido23. A causa di una mancata corrispondenza delle forze magnetiche, gli SH non sono attualmente compatibili con gli unipucks. Lo stoccaggio e la spedizione sono realizzati utilizzando pettine (vedi tabella dei materiali), che sono disponibili per gli utenti su richiesta, insieme agli inserti di spedizione a secco compatibili (Figura 3C). Questi puck condividono la stessa piastra di base con gli unipucks ampiamente utilizzati e consentono un rapido pre-screening dei campioni su altre beamline Diamond MX. Il prestito di questa apparecchiatura agli utenti è attualmente la soluzione migliore, fino a quando i possessori di campioni su misura non saranno disponibili in commercio. Il trasporto alla beamline richiede gli spedizionieri a secco standard utilizzati nella comunità MX.
Fase 2: Trasferimento di campioni criorefrizionati nella stazione terminale del vuoto
Una volta che i campioni arrivano sulla beamline, vengono preparati per il trasferimento nella stazione terminale del vuoto. Ciò comporta la rimozione di SHs dai pettinati e la separazione dagli adattatori. L’introduzione di campioni biologici nel vuoto viene eseguita abitualmente nel campo della microscopia crioelettronica. Alcuni dei concetti consolidati sono stati adattati per il trasferimento del campione I23. In breve, gli SH vengono trasferiti sotto azoto liquido su blocchi di trasferimento (Figura 3D). Questi blocchi hanno un’eccellente conduttività termica e una massa termica significativa, impedendo ai cristalli di raggiungere la temperatura di transizione vetrosa quando sono sotto vuoto. Fino a quattro blocchi, con una capacità di quattro campioni ciascuno, vengono caricati sotto azoto liquido in un disco di blocco (Figura 3H), che viene utilizzato sia per il trasferimento di campioni al sistema di trasferimento criogenico (CTS) o per lo stoccaggio in azoto liquido dewars tra gli esperimenti.
Il sistema di trasferimento criogenico sviluppato presso Diamond Light Source comprende due sottoinsiemi, la stazione campione e lo shuttle (Figura 4A). La Sample Station è costituita da un bagno di azoto liquido per la conservazione temporanea di cristalli proteici e ha caratteristiche specifiche per garantire la sicurezza e consentire un’esperienza user-friendly (Figura 5). Il CTS è controllato da un controller logico programmabile tramite un’interfaccia touchscreen intuitiva. La stazione di campionamento ha diodi emettitori di luce integrati per una migliore visualizzazione e una serie di riscaldatori controllati in circuito chiuso per automatizzare l’essiccazione del bagno di azoto liquido una volta che i campioni sono stati trasferiti. Ha anche una varietà di sensori per garantire la sicurezza e il funzionamento efficiente del sistema. La sample station dispone di hardware su misura per fornire un’interfaccia elettrica affidabile per interagire con la navetta per le operazioni, come il pompaggio fino al vuoto grezzo per il trasferimento del campione, nonché il monitoraggio dei livelli di azoto liquido e della temperatura all’interno della navetta.
Lo Shuttle (Figura 6) è un dispositivo portatile utilizzato per prelevare un blocco di trasferimento dal bagno di azoto liquido della Sample Station e trasferirlo all’interno di un ambiente criogenico e vuoto alla stazione finale. Include un dewar di azoto liquido per mantenere i campioni freddi durante il trasferimento, il monitoraggio del livello del liquido nel dewar e una varietà di sensori per il funzionamento e la sicurezza dell’utente. Il braccio di trasferimento è dotato di un azionamento magnetico e include scanalature lavorate per guidare gli utenti nel carico e nello scarico sicuri dei blocchi di trasferimento nella stazione finale. Il trasferimento dalla navetta al recipiente a vuoto viene effettuato tramite una camera d’aria. L’airlock è un’interfaccia per lo shuttle sulla stazione terminale utilizzata per evacuare l’intercapedine tra la navetta e la stazione terminale, prima di aprire le valvole del vuoto dello shuttle e della stazione finale. Le sequenze di pompaggio e sfiato sono completamente automatizzate e possono essere azionate tramite un ampio touchscreen con un’interfaccia user-friendly (Figura 4C). L’attuale protocollo viene utilizzato per trasferire un cristallo di taumatina alla stazione terminale del vuoto per la raccolta dei dati.
L’attuale protocollo è stato sviluppato per soddisfare i requisiti di preparazione del campione per gli esperimenti MX a lunghezza d’onda lunga nel vuoto sulla beamline I23. È stato in uso sulla beamline nell’ultimo anno e ha contribuito al completamento con successo di più progetti. Come indicato dai risultati qui presentati, il protocollo consente un trasferimento sicuro e affidabile dei campioni alla stazione terminale del vuoto preservandone la qualità di diffrazione. È un aspetto importante per il funzionamento della beamline e sarà accompagnato da una formazione di persona degli utenti da parte del personale della beamline. Alcuni dei passaggi meritano di essere evidenziati come critici per il completamento efficace e sicuro della procedura: il trasferimento di campioni da basi di pettine a blocchi di campioni richiede accuratezza e attenzione per evitare di danneggiare i campioni (vedi passaggio 2.1.4); il monitoraggio del livello di azoto liquido in tutte le fasi è importante per evitare che i campioni siano esposti all’aria o siano a stretto contatto con parti non adeguatamente raffreddate (2.1.3 e 2.2.2); attendere che la sequenza di chiusura (2.2.14) sia completamente terminata, prima di rimuovere la navetta dalla stazione finale (2.2.15), per evitare il degrado del vuoto della stazione finale.
La concezione del protocollo è stata avviata insieme a uno sforzo ingegneristico volto a sviluppare apparecchiature appositamente costruite per il trasferimento di cristalli proteici nell’ambiente del vuoto. I prodotti finali di questo progetto sono stati il CTS e gli strumenti di gestione dei campioni associati sopra descritti. Il CTS è un miglioramento significativo rispetto al suo predecessore, il Leica EM VCT10014, e rimuove molteplici limitazioni, come la mancanza di schermatura del campione e l’ambiente di vuoto durante il trasferimento, l’accumulo di ghiaccio all’interno del bagno di azoto liquido e l’assenza di un’interfaccia utente intuitiva e di funzioni di sicurezza. Ulteriori caratteristiche del CTS che migliorano l’esperienza dell’utente sono il monitoraggio della temperatura e del livello di azoto liquido all’interno della navetta e della stazione di campionamento, un bagno di maggiore capacità che ospita quattro blocchi contemporaneamente, anziché uno, e un meccanismo autoguidato per il funzionamento dello shuttle. Il CTS è completamente integrato nel sistema di controllo della beamline con un’interfaccia touchscreen intuitiva e una maggiore sicurezza meccanica e del vuoto quando si interfaccia con la stazione finale.
Beamline I23 è il primo strumento di sincrotrone MX a lunghezza d’onda lunga del suo genere e, come tale, l’introduzione di cristalli proteici in un ambiente ad alto vuoto e la loro conservazione a temperature criogeniche, ha richiesto sforzi considerevoli. I miglioramenti agli strumenti e al protocollo di preparazione dei campioni, nonché gli sforzi per semplificare i processi, sono in corso. Come parte del supporto utente, il personale beamline è sempre disponibile per assistere con la risoluzione dei problemi. Un esempio di uno di questi scenari potrebbero essere i problemi che compromettono l’integrità del sistema di vuoto, portando a difficoltà nel collegare o rimuovere la navetta da / per il CTS o l’airlock della stazione terminale. Diversi livelli di test vengono eseguiti su base settimanale e giornaliera e la formazione degli utenti coprirà ulteriori controlli per evitare potenziali guasti, come l’ispezione visiva degli O ring sulle interfacce a cui si collega la navetta. Mentre l’ambiente del vuoto apre l’opportunità di eseguire esperimenti di diffrazione in un intervallo di lunghezze d’onda non accessibile ad altre linee di fascio, la fase di trasferimento aggiuntiva riduce la produttività complessiva del campione.
Il trasferimento manuale con solo quattro campioni per blocco di trasferimento e fino a cinque blocchi all’interno del recipiente a vuoto limita la capacità totale a 20 campioni. Quindi, per i progetti con una grande variabilità da campione a campione, i campioni dovrebbero essere pre-selezionati presso le linee di fascio Diamond ad alta produttività, e quindi solo i campioni più promettenti dovrebbero essere trasferiti per il successivo esperimento ottimizzato a lunga lunghezza d’onda. Mentre i portacampioni e i blocchi di trasferimento sono invariati rispetto alla loro introduzione iniziale di alcuni anni fa, gli strumenti di gestione presentati qui sono tutti nuovi sviluppi. I portacampioni dedicati I23 sono immutabili grazie al loro ruolo nel concetto di raffreddamento per la beamline. Pertanto, la progettazione degli strumenti di gestione dei campioni mirava a creare un collegamento tra questo nuovo tipo di supporto e gli strumenti standard disponibili in commercio che la comunità di utenti MX aveva adottato per lungo tempo, come i pettini, le bacchette per la raccolta dei cristalli e il sistema di trasporto dello spedizioniere secco. Il loro design ha comportato una consultazione significativa con la comunità degli utenti e ha richiesto diverse iterazioni per essere completate. L’attrezzatura, gli strumenti e il protocollo qui presentati rappresentano un sistema semplice e robusto per il trasferimento di campioni utente per esperimenti presso la beamline I23 presso Diamond Light Source. Questo strumento per la cristallografia macromolecolare a lunghezza d’onda lunga nel vuoto apre nuove opportunità per la biologia strutturale.
Vorremmo ringraziare Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha e Kevin Wilkinson per il loro supporto nello sviluppo del Cryogenic Sample Transfer System (CTS). Questo lavoro è stato finanziato da iNEXT-Discovery (Grant 871037) finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea.
12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |