Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента
Summary
Здесь мы представляем протокол для надежной генерации и расширения кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента.
Abstract
Получение специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови привлекло огромный интерес к прецизионной медицине сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечная дифференцировка из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) модулируется определенными сигнальными путями, которые необходимы для эмбрионального развития сердца. Разработаны многочисленные методы сердечной дифференцировки на 2-D и 3-D платформах с различной эффективностью и выходом кардиомиоцитов. Это озадачило исследователей за пределами поля, поскольку разнообразие этих методов может быть трудно проследить. Здесь мы представляем комплексный протокол, который разрабатывает надежную генерацию и расширение специфических для пациента кардиомиоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Сначала мы опишем высокоэффективный протокол перепрограммирования iPSC из образца крови пациента с использованием неинтегрированных векторов вируса Сендай. Затем мы подробно описываем метод дифференцировки монослоя с небольшими молекулами, который может надежно производить бьющиеся кардиомиоциты из большинства линий iPSC человека. Кроме того, масштабируемый протокол расширения кардиомиоцитов вводится с использованием небольшой молекулы (CHIR99021), которая может быстро расширять кардиомиоциты, полученные от пациента, для промышленного и клинического применения. В конце изображены подробные протоколы молекулярной идентификации и электрофизиологической характеристики этих iPSC-CM. Мы ожидаем, что этот протокол будет прагматичным для новичков с ограниченными знаниями в области сердечно-сосудистого развития и биологии стволовых клеток.
Introduction
Открытие индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток произвело революцию в современной сердечно-сосудистоймедицине1,2. Человеческие ИПСК способны самообновляться и генерировать все типы клеток в сердце, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и сердечные фибробласты. Кардиомиоциты пациента, полученные из iPSC (iPSC-CMs), могут служить неопределенными ресурсами для моделирования генетически наследуемых сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и тестирования сердечной безопасности для новых лекарств3. В частности, пациенты iPSC-CMs хорошо подготовлены к исследованию генетической и молекулярной этиологии ССЗ, которые получены из дефектов кардиомиоцитов, таких как синдром удлиненного интервала QT4 и дилатационная кардиомиопатия (DCM)5. В сочетании с CRISPR/Cas9-опосредованным редактированием генома, iPSC-CM пациентов открыли беспрецедентный путь к пониманию сложной генетической основы ССЗ, включая врожденные пороки сердца (ИБС)6,7,8. Человеческие iPSC-CM также продемонстрировали потенциал служить аутологичными клеточными источниками для пополнения поврежденного миокарда во время сердечного приступа9. В последние годы первостепенное значение приобрела генерация высококачественных человеческих iPSC-CM с определенными подтипами (предсердные, желудочковые и узловые) для регенерации сердца и тестирования лекарств10.
Сердечная дифференциация от человеческих ИПСК значительно продвинулась за последнее десятилетие. Методы дифференцировки перешли от спонтанной дифференцировки на основе эмбриоидного тела (EB) к химически определенной и направленной сердечной дифференцировке11. Ключевые сигнальные молекулы, необходимые для эмбрионального развития сердца, такие как Wnt, BMP, Nodal и FGF, манипулируются для усиления дифференцировки кардиомиоцитов от ИПСК человека10,12. Значительные достижения включают последовательную модуляцию передачи сигналов Wnt (активация с последующим ингибированием) для надежной генерации кардиомиоцитов из человеческих ИПСК13,14. Химически определенные рецепты сердечной дифференцировки были изучены для облегчения крупномасштабного производства бьющихся кардиомиоцитов15,16,которые могут быть модернизированы до промышленного и клинического уровня производства. Кроме того, устойчивое расширение ранних человеческих iPSC-CM достигается воздействием конститутивной активации Wnt с использованием небольшого химического вещества (CHIR99021)17. В последнее время специфические для подтипа кардиомиоциты генерируются путем манипуляций с сигнальными путями ретиноевой кислоты (РА) и Wnt в определенных окнах дифференцировки во время приверженности линии кардиомиоцитов от человеческих ИПСК18,19,20,21,22.
В этом протоколе мы подробно описываем рабочую процедуру для надежной генерации и пролиферации человеческих КМ, происходящих из мононуклеарных клеток периферической крови пациента. Мы представляем протоколы для 1) перепрограммирования человеческих PBMC в iPSCs, 2) надежной генерации бьющихся кардиомиоцитов из человеческих IPSCs, 3) быстрого расширения ранних iPSC-CM, 4) молекулярной характеристики человеческих iPSC-CM и 5) электрофизиологического измерения человеческих iPSC-CM на уровне одноклеточных клеток с помощью зажима пластыря. Этот протокол охватывает подробные экспериментальные процедуры по преобразованию клеток крови пациента в биение кардиомиоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время перепрограммирования iPSC крайне важно культивировать PBMC в течение 1 недели, пока они не будут увеличены прозрачными ядрами и цитоплазмой. Поскольку PBMC не размножаются, соответствующий номер клеток для вирусной трансдукции важен для успешного перепрограммирования iPSC. Количест?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано премией Американской кардиологической ассоциации (AHA) за развитие карьеры 18CDA34110293 (M-T.Z.), наградами AVIF и SVRF (M-T.Z.), грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 и R01HL096962 (I.D.). Доктор Мин-Тао Чжао также получил поддержку стартовых фондов из Исследовательского института Эбигейл Векснер при Национальной детской больнице.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
