Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.
Abstract
A geração de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de uma única coleta de sangue tem atraído enorme interesse em medicina de precisão em doenças cardiovasculares. A diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) é modulada por vias de sinalização definidas que são essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário. Inúmeros métodos de diferenciação cardíaca em plataformas 2D e 3D foram desenvolvidos com várias eficiências e rendimento de cardiomiócitos. Isso tem intrigado investigadores fora do campo, pois a variedade desses métodos pode ser difícil de seguir. Aqui apresentamos um protocolo abrangente que elabora geração robusta e expansão de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs). Primeiro descrevemos um protocolo de reprogramação iPSC de alta eficiência a partir da amostra de sangue de um paciente usando vetores de vírus Sendai não integração. Em seguida, detalhamos um pequeno método de diferenciação de monocamadas mediada por moléculas que pode produzir robustamente cardiomiócitos de batida da maioria das linhas iPSC humanas. Além disso, um protocolo escalável de expansão do cardiomiócito é introduzido usando uma pequena molécula (CHIR99021) que poderia expandir rapidamente cardiomiócitos derivados do paciente para aplicações de grau industrial e clínico. No final, são retratados protocolos detalhados para identificação molecular e caracterização eletrofisiológica desses iPSC-CMs. Esperamos que este protocolo seja pragmático para iniciantes com conhecimento limitado sobre desenvolvimento cardiovascular e biologia de células-tronco.
Introduction
A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem revolucionou a medicina cardiovascular moderna1,2. IPSCs humanos são capazes de se auto-renovar e gerar todos os tipos de células no coração, incluindo cardiomiócitos, células endividadas, células musculares lisas e fibroblastos cardíacos. Cardiomiócitos derivados do paciente iPSC (iPSC-CMs) podem servir como recursos indefinidos para modelagem de doenças cardiovasculares geneticamente hereditárias (DCV) e testes de segurança cardíaca para novos medicamentos3. Em particular, os pacientes iPSC-CMs estão bem preparados para investigar etiologias genéticas e moleculares de DCV que são derivadas de defeitos em cardiomiócitos, como síndrome de QT longa4 e cardiomiopatia dilatada (DCM)5. Combinados com a edição de genoma mediada pelo CRISPR/Cas9, os pacientes iPSC-CMs abriram uma avenida sem precedentes para entender a complexa base genética de DCV, incluindo defeitos cardíacos congênitos (CHDs)6,7,8. Os iPSC-CMs humanos também apresentaram potenciais para servir como fontes de células autólogas para repor o miocárdio danificado durante um ataque cardíaco9. Nos últimos anos, tornou-se primordial gerar iPSC-CMs humanos de alta qualidade com subtipos definidos (atrial, ventricular e nodal) para regeneração cardíaca e teste de drogas10.
A diferenciação cardíaca dos iPSCs humanos tem sido muito avançada na última década. Os métodos de diferenciação passaram da diferenciação espontânea baseada no corpo embrionário (EB) para a diferenciação cardíaca quimicamente definida e direcionada11. As principais moléculas de sinalização essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário, como Wnt, BMP, Nodal e FGF são manipuladas para melhorar a diferenciação de cardiomiócitos dos iPSCs humanos10,12. Avanços significativos incluem modulação sequencial de sinalização Wnt (ativação seguida de inibição) para geração robusta de cardiomiócitos a partir de iPSCs humanos13,14. Receitas de diferenciação cardíaca quimicamente definidas têm sido exploradas para facilitar a produção em larga escala de cardiomiócitosbatendo 15,16, que têm potencial para serem atualizados para a produção de nível industrial e clínico. Além disso, a expansão robusta dos IPSC-CMs humanos precoces é alcançada pela exposição à ativação constitutiva do Wnt utilizando um pequeno produto químico (CHIR99021)17. Mais recentemente, cardiomiócitos específicos do subtipo são gerados através da manipulação de vias de sinalização de ácido retinóico (RA) e Wnt em janelas específicas de diferenciação durante o compromisso de linhagem cardiomiocócica dos iPSCs humanos18,19,20,21,22.
Neste protocolo, detalhamos um procedimento de trabalho para geração robusta e proliferação de CMs humanos originários de células mononucleares sanguíneos periféricos do paciente. Apresentamos protocolos para 1) reprogramação de PBMCs humanos para iPSCs, 2) geração robusta de cardiomiócitos pulsantes de iPSCs humanos, 3) expansão rápida de IPSC-CMs precoces, 4) caracterização molecular de iPSC-CMs humanos e 5) medição eletrofisiológica de iPSC-CMs humanos no nível unicelular por remendo. Este protocolo abrange os procedimentos experimentais detalhados na conversão de células sanguíneas do paciente em cardiomiócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante a reprogramação do IPSC, é fundamental cultivar PBMCs por 1 semana até que sejam ampliados com núcleos claros e citoplasma. Como os PBMCs não proliferam, um número celular apropriado para transdução viral é importante para a reprogramação bem sucedida do iPSC. O número celular de PBMCs, a multiplicidade de infecção (MOI) e o título do vírus devem ser considerados e ajustados para alcançar os resultados ideais de transdução. Para a diferenciação cardíaca, a densidade inicial de semeadura é …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Adicional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) concede 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao também foi apoiado por fundos de startup do Instituto de Pesquisa Abigail Wexner no Nationalwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
