Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.
Abstract
La generación de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre ha atraído un gran interés en la medicina de precisión sobre las enfermedades cardiovasculares. La diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) está modulada por vías de señalización definidas que son esenciales para el desarrollo del corazón embrionario. Se han desarrollado numerosos métodos de diferenciación cardíaca en plataformas 2-D y 3-D con diversas eficiencias y rendimiento de cardiomiocitos. Esto ha desconcertado a los investigadores fuera del campo, ya que la variedad de estos métodos puede ser difícil de seguir. Aquí presentamos un protocolo integral que elabora una generación y expansión robustas de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Primero describimos un protocolo de reprogramación iPSC de alta eficiencia a partir de la muestra de sangre de un paciente utilizando vectores del virus de Sendai no integrados. A continuación, detallamos un pequeño método de diferenciación monocapa mediado por moléculas que puede producir cardiomiocitos de latido robusto a partir de la mayoría de las líneas iPSC humanas. Además, se introduce un protocolo de expansión de cardiomiocitos escalable utilizando una molécula pequeña (CHIR99021) que podría expandir rápidamente los cardiomiocitos derivados del paciente para aplicaciones de grado industrial y clínico. Al final, se representan protocolos detallados para la identificación molecular y la caracterización electrofisiológica de estos iPSC-CM. Esperamos que este protocolo sea pragmático para principiantes con conocimientos limitados sobre desarrollo cardiovascular y biología de células madre.
Introduction
El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas por humanos ha revolucionado la medicina cardiovascular moderna1,2. Las iPSC humanas son capaces de autorrenovarse y generar todos los tipos de células en el corazón, incluidos los cardiomiocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y los fibroblastos cardíacos. Los cardiomiocitos derivados de iPSC para pacientes (iPSC-CM) pueden servir como recursos indefinidos para modelar enfermedades cardiovasculares genéticamente hereditarias (ECV) y probar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos3. En particular, los iPSC-CM de los pacientes están bien preparados para investigar etiologías genéticas y moleculares de las ECV que se derivan de defectos en los cardiomiocitos, como el síndrome de QT largo4 y la miocardiopatía dilatada (DCM)5. Combinados con la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9, los iPSC-CM de los pacientes han abierto una vía sin precedentes para comprender la compleja base genética de las ECV, incluidos los defectos cardíacos congénitos (CHD)6,7,8. Los iPSC-CM humanos también han exhibido potenciales para servir como fuentes de células autólogas para reponer el miocardio dañado durante un ataque cardíaco9. En los últimos años, se ha vuelto primordial generar iPSC-CM humanos de alta calidad con subtipos definidos (auricular, ventricular y nodal) para la regeneración cardíaca y las pruebas de drogas10.
La diferenciación cardíaca de las iPSC humanas ha avanzado mucho en la última década. Los métodos de diferenciación han pasado de la diferenciación espontánea basada en el cuerpo embrionario (EB) a la diferenciación cardíaca químicamente definida y dirigida11. Las moléculas de señalización clave esenciales para el desarrollo embrionario del corazón, como Wnt, BMP, Nodal y FGF, se manipulan para mejorar la diferenciación de los cardiomiocitos de las iPSC humanas10,12. Los avances significativos incluyen la modulación secuencial de la señalización Wnt (activación seguida de inhibición) para la generación robusta de cardiomiocitos a partir de iPSCs humanas13,14. Se han explorado recetas de diferenciación cardíaca definidas químicamente para facilitar la producción a gran escala de cardiomiocitos de latido15,16, que tienen el potencial de actualizarse a la producción a nivel industrial y clínico. Además, la expansión robusta de los primeros iPSC-CM humanos se logra mediante la exposición a la activación constitutiva de Wnt utilizando un pequeño producto químico (CHIR99021)17. Más recientemente, los cardiomiocitos específicos del subtipo se generan a través de la manipulación de las vías de señalización de ácido retinoico (AR) y Wnt en ventanas de diferenciación específicas durante el compromiso del linaje de cardiomiocitos de iPSCs humanas18,19,20,21,22.
En este protocolo, detallamos un procedimiento de trabajo para la generación robusta y proliferación de CM humanos originados en células mononucleares de sangre periférica del paciente. Presentamos protocolos para 1) reprogramar PBMC humanos a iPSCs, 2) generación robusta de cardiomiocitos de latidos a partir de iPSCs humanos, 3) expansión rápida de iPSC-CMs tempranos, 4) caracterización molecular de iPSC-CMs humanos, y 5) medición electrofisiológica de iPSC-CM humanos a nivel de una sola célula por pinza de parche. Este protocolo cubre los procedimientos experimentales detallados para convertir las células sanguíneas de los pacientes en cardiomiocitos que golpean.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la reprogramación de iPSC, es fundamental cultivar PBMC durante 1 semana hasta que se agranden con núcleos y citoplasma claros. Debido a que los PBMC no proliferan, un número de células apropiado para la transducción viral es importante para una reprogramación exitosa de iPSC. El número celular de PBMC, la multiplicidad de la infección (MOI) y el título del virus deben considerarse y ajustarse para alcanzar los resultados óptimos de transducción. Para la diferenciación cardíaca, la densidad de siembr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional 18CDA34110293 (M-T.Z.) de la American Heart Association (AHA), los premios AVIF y SVRF de La American Heart Association (M-T.Z.), las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 y R01HL096962 (I.D.). El Dr. Ming-Tao Zhao también recibió el apoyo de fondos iniciales del Instituto de Investigación Abigail Wexner en el Nationwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
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