Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.
Abstract
La generazione di cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue ha attirato un enorme interesse per la medicina di precisione sulle malattie cardiovascolari. La differenziazione cardiaca dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) è modulata da percorsi di segnalazione definiti che sono essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale. Numerosi metodi di differenziazione cardiaca su piattaforme 2D e 3D sono stati sviluppati con varie efficienze e resa cardiomiocitaria. Ciò ha sconcertato gli investigatori al di fuori del campo in quanto la varietà di questi metodi può essere difficile da seguire. Qui presentiamo un protocollo completo che elabora una robusta generazione ed espansione di cardiomiociti specifici del paziente da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per prima cosa descriviamo un protocollo di riprogrammazione iPSC ad alta efficienza dal campione di sangue di un paziente utilizzando vettori di virus Sendai non integrati. Quindi descriviamo in dettaglio un piccolo metodo di differenziazione monostrato mediato da molecole che può produrre in modo robusto cardiomiociti battenti dalla maggior parte delle linee iPSC umane. Inoltre, viene introdotto un protocollo di espansione dei cardiomiociti scalabile utilizzando una piccola molecola (CHIR99021) che potrebbe espandere rapidamente i cardiomiociti derivati dal paziente per applicazioni di livello industriale e clinico. Alla fine, vengono illustrati protocolli dettagliati per l’identificazione molecolare e la caratterizzazione elettrofisiologica di questi iPSC-CM. Ci aspettiamo che questo protocollo sia pragmatico per i principianti con conoscenze limitate sullo sviluppo cardiovascolare e sulla biologia delle cellule staminali.
Introduction
La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo ha rivoluzionato la moderna medicina cardiovascolare1,2. Le iPSC umane sono in grado di auto-rinnovarsi e generare tutti i tipi di cellule nel cuore, compresi cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e fibroblasti cardiaci. I cardiomiociti derivati da iPSC del paziente (iPSC-CM) possono servire come risorse indefinite per modellare le malattie cardiovascolari geneticamente ereditabili (CVD) e testare la sicurezza cardiaca per i nuovi farmaci3. In particolare, i pazienti iPSC-CM sono ben pronti a studiare le eziologie genetiche e molecolari delle CVD derivate da difetti nei cardiomiociti, come la sindrome del QT lungo4 e la cardiomiopatia dilatativa (DCM)5. In combinazione con l’editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9, i CM iPSC dei pazienti hanno aperto una strada senza precedenti per comprendere le complesse basi genetiche delle CVD, compresi i difetti cardiaci congeniti (CHD)6,7,8. Gli iPSC-CM umani hanno anche mostrato potenziali per servire come fonti cellulari autologhe per reintegrare il miocardio danneggiato durante un infarto9. Negli ultimi anni, è diventato fondamentale generare iPSC-CM umani di alta qualità con sottotipi definiti (atriale, ventricolare e nodale) per la rigenerazione cardiaca e test antidroga10.
La differenziazione cardiaca dalle iPSC umane è stata notevolmente avanzata negli ultimi dieci anni. I metodi di differenziazione sono passati dalla differenziazione spontanea basata sul corpo embrioide (EB) alla differenziazione cardiaca chimicamente definita e diretta11. Le molecole di segnalazione chiave essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale, come Wnt, BMP, Nodal e FGF sono manipolate per migliorare la differenziazione dei cardiomiociti dalle iPSC umane10,12. Progressi significativi includono la modulazione sequenziale della segnalazione Wnt (attivazione seguita da inibizione) per una robusta generazione di cardiomiociti da iPSC umane13,14. Sono state esplorate ricette di differenziazione cardiaca chimicamente definite per facilitare la produzione su larga scala di cardiomiociti battenti15,16, che hanno il potenziale per essere aggiornati alla produzione a livello industriale e clinico. Inoltre, una robusta espansione delle iPSC-CM umane precoci si ottiene mediante l’esposizione all’attivazione costitutiva di Wnt utilizzando una piccola sostanza chimica (CHIR99021)17. Più recentemente, i cardiomiociti specifici del sottotipo sono generati attraverso la manipolazione delle vie di segnalazione dell’acido retinoico (RA) e Wnt in specifiche finestre di differenziazione durante l’impegno del lignaggio dei cardiomiociti dalle iPSC umane18,19,20,21,22.
In questo protocollo, descriviamo in dettaglio una procedura di lavoro per la generazione e la proliferazione robuste di CM umane provenienti da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente. Presentiamo protocolli per 1) riprogrammazione di PBMC umani in iPSC, 2) robusta generazione di cardiomiociti battenti da iPSC umane, 3) rapida espansione dei primi iPSC-CM, 4) caratterizzazione molecolare di iPSC-CM umani e 5) misurazione elettrofisiologica di iPSC-CM umani a livello di singola cellula mediante patch clamp. Questo protocollo copre le procedure sperimentali dettagliate sulla conversione delle cellule del sangue del paziente in cardiomiociti pulsanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la riprogrammazione iPSC, è fondamentale coltivare PBMC per 1 settimana fino a quando non vengono ingranditi con nuclei chiari e citoplasma. Poiché i PBMC non proliferano, un numero di cellule appropriato per la trasduzione virale è importante per una riprogrammazione iPSC di successo. Il numero di cellule pbMC, la molteplicità dell’infezione (MOI) e il titolo del virus devono essere considerati e regolati per raggiungere i risultati di trasduzione ottimali. Per la differenziazione cardiaca, la densità inizi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dall’American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) sovvenzioni 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Il Dr. Ming-Tao Zhao è stato anche supportato da fondi di avvio dell’Abigail Wexner Research Institute presso il Nationwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
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