توليد وتوسيع خلايا القلب البشرية من خلايا الدم المحيطية المريض أحادية النووية
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد وتوسيع خلايا القلب البشرية بقوة من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية المريض.
Abstract
وقد اجتذب توليد خلايا القلب المريض محددة من سحب الدم واحد اهتماما هائلا في الطب الدقيق على أمراض القلب والأوعية الدموية. يتم تعديل التمايز القلبي عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs) من خلال مسارات إشارات محددة ضرورية لنمو القلب الجنيني. تم تطوير العديد من طرق التمايز القلبي على منصات 2-D و 3-D بكفاءات مختلفة وغلة خلايا القلب. وقد حير ذلك المحققين خارج الميدان لأن تنوع هذه الأساليب قد يكون من الصعب اتباعه. هنا نقدم بروتوكول شامل يوضح توليد قوي وتوسيع خلايا القلب الخاصة بالمرضى من خلايا الدم الأحادية النووية الطرفية (PBMCs). نحن أول وصف بروتوكول إعادة برمجة iPSC عالية الكفاءة من عينة دم المريض باستخدام ناقلات فيروس سينداي عدم التكامل. ثم نقوم بتفصيل طريقة تمايز أحادية الطبقة صغيرة بوساطة الجزيء يمكن أن تنتج بقوة ضربات خلايا القلب من معظم خطوط iPSC البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إدخال بروتوكول توسيع خلايا القلب القابلة للتطوير باستخدام جزيء صغير (CHIR99021) يمكن أن يوسع بسرعة خلايا القلب المشتقة من المريض للتطبيقات الصناعية والسريرية. وفي النهاية، يتم تصوير بروتوكولات مفصلة لتحديد الهوية الجزيئية والتوصيف الكهربي لهذه iPSC-CMs. نتوقع أن يكون هذا البروتوكول عمليا للمبتدئين ذوي المعرفة المحدودة حول تطوير القلب والأوعية الدموية وبيولوجيا الخلايا الجذعية.
Introduction
اكتشاف الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان متعدد القدرات قد أحدثت ثورة في طب القلب والأوعية الدموية الحديث1،2. iPSCs الإنسان قادرون على تجديد الذات وتوليد جميع أنواع الخلايا في القلب، بما في ذلك خلايا القلب والخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية القلبية. يمكن أن تعمل خلايا القلب المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) كموارد غير محددة الأجل لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية الموروثة وراثيا (CVDs) واختبار سلامة القلب للأدوية الجديدة3. على وجه الخصوص ، يستعد المريض iPSC-CMs جيدا للتحقيق في الارتطولوجيا الوراثية والجزيئية للأمراض القلبية الوعائية المشتقة من عيوب في خلايا القلب ، مثل متلازمة QT الطويلة4 واعتلال عضلة القلب المتوسع (DCM)5. جنبا إلى جنب مع CRISPR /Cas9 بوساطة تحرير الجينوم، فتحت المريض iPSC-CMs وسيلة غير مسبوقة لفهم الأساس الوراثي المعقد للأمراض القلبية الوعائية بما في ذلك عيوب القلب الخلقية (CHDs)6،7،8. وقد أظهرت iPSC-CMs الإنسان أيضا إمكانات لتكون بمثابة مصادر الخلايا الذاتية لتجديد عضلة القلب التالفة خلال نوبة قلبية9. في السنوات الأخيرة، أصبح من الأهمية بمكان لتوليد عالية الجودة iPSC-CMs الإنسان مع أنواع فرعية محددة (الأذينية والبطينية والدال) لتجديد القلب واختبار المخدرات10.
وقد تم التمايز القلبي من iPSCs الإنسان متقدمة إلى حد كبير في العقد الماضي. وقد تحولت أساليب التمايز من التمايز التلقائي القائم على الجسم الجنيني (EB) إلى التمايز القلبي المحدد كيميائيا والموجه11. يتم التلاعب جزيئات الإشارات الرئيسية الضرورية لنمو القلب الجنيني، مثل WNT، BMP، العقد، وGFGF لتعزيز التمايز cardiomyocyte من iPSCs الإنسان10،12. وتشمل التطورات الهامة التشكيل التسلسلي للإشارات WNT (التنشيط تليها تثبيط) لتوليد قوي من خلايا القلب من iPSCs الإنسان13،14. تم استكشاف وصفات التمايز القلبي المحددة كيميائيا لتسهيل الإنتاج على نطاق واسع من خلايا القلبالنابضة 15،16، والتي لديها القدرة على الترقية إلى الإنتاج الصناعي والسريري. وعلاوة على ذلك، يتم تحقيق التوسع القوي في وقت مبكر iPSC-CMs الإنسان من خلال التعرض لتنشيط WNT التأسيسية باستخدام مادة كيميائية صغيرة (CHIR99021)17. في الآونة الأخيرة ، يتم إنشاء خلايا القلب الخاصة بالنوع الفرعي من خلال التلاعب بحمض الريتينويك (RA) ومسارات إشارات Wnt في نوافذ تمايز محددة أثناء التزام نسب القلب والخلايا القلبية من iPSCs البشري18و19و20و21و22.
في هذا البروتوكول، نقوم بتفصيل إجراء عمل لتوليد قوي وانتشار CMs الإنسان الناشئة من خلايا الدم المحيطي المريض أحادية النووية. نقدم بروتوكولات ل1) إعادة برمجة PBMCs الإنسان إلى iPSCs، 2) جيل قوي من ضربات خلايا القلب من iPSCs الإنسان، 3) التوسع السريع في وقت مبكر iPSC-CMs، 4) التوصيف الجزيئي للإنسان iPSC-CMs، و 5) القياس الكهربي من iPSC-CMs الإنسان على مستوى خلية واحدة عن طريق المشبك التصحيح. يغطي هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية التفصيلية حول تحويل خلايا دم المريض إلى خلايا القلب النابضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلال إعادة برمجة iPSC ، من المهم زراعة PBMCs لمدة أسبوع واحد حتى يتم توسيعها مع نواة واضحة وسيتوبلازم. ونظرا لعدم انتشار PBMCs، فإن رقم الخلية المناسب لاتحواث الفيروس مهم لإعادة برمجة iPSC بنجاح. وينبغي النظر في عدد الخلايا من PBMCs، وتعدد العدوى (MOI) وترايتر الفيروس وتعديلها للوصول إلى نتائج النقل ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل جمعية القلب الأمريكية (AHA) جائزة التطوير الوظيفي 18CDA34110293 (M-T.Z.) ، والمشاريع الإضافية AVIF وجوائز SVRF (M-T.Z.) ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH / NHLBI) منح 1R01HL124245 ، 1R01HL132520 و R01HL096962 (I.D.). كما تم دعم الدكتور مينغ تاو تشاو من أموال الشركات الناشئة من معهد أبيغيل ويكسنر للأبحاث في مستشفى نيشن وايد للأطفال.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
