Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.
Tek bir kan alımından hastaya özgü kardiyomiyositler üretmek, kardiyovasküler hastalık üzerinde hassas tıbba büyük ilgi çekmiştir. İnsan indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kardiyak farklılaşma, embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan tanımlanmış sinyal yolları ile modüle edilir. 2-B ve 3 boyutlu platformlarda çok sayıda kardiyak farklılaşma yöntemi çeşitli verimlilikler ve kardiyomiyosit verimi ile geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çeşitliliği takip etmek zor olabileceği için bu, alanın dışındaki araştırmacıların kafasını karıştırdı. Burada, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ ler) hastaya özgü kardiyomiyositlerin sağlam bir şekilde üretilmesini ve genişlemesini ayrıntılı olarak anlatan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, entegrasyonsuz Sendai virüs vektörleri kullanarak bir hastanın kan örneğinden yüksek verimli bir iPSC yeniden programlama protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, çoğu insan iPSC hattından dayak kardiyomiyositleri sağlam bir şekilde üretebilen küçük bir molekül aracılı monolayer farklılaşma yöntemini detaylandırıyoruz. Ek olarak, endüstriyel ve klinik sınıf uygulamalar için hasta kaynaklı kardiyomiyositleri hızla genişletebilen küçük bir molekül (CHIR99021) kullanılarak ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit genişletme protokolü getirilmiştir. Sonunda, bu iPSC-CM’lerin moleküler tanımlaması ve elektrofizyolojik karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller tasvir edilir. Bu protokolün kardiyovasküler gelişim ve kök hücre biyolojisi hakkında sınırlı bilgiye sahip yeni başlayanlar için pragmatik olmasını bekliyoruz.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin keşfi modern kardiyovasküler tıpta devrim yaptı1,2. İnsan iPSC’leri kardiyomiyositler, endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve kardiyak fibroblastlar da dahil olmak üzere kalpteki tüm hücre tiplerini kendi kendine yenileyebilir ve üretebilir. Hasta iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM’ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD’ ler) modellanması ve yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilebilmesi için süresiz kaynaklar olarak hizmet edebilir3. Özellikle, hasta iPSC-CM’ler, uzun QT sendromu4 ve genişlemiş kardiyomiyopati (DCM)5gibi kardiyomiyositlerdeki kusurlardan elde edilen CVD’lerin genetik ve moleküler etiyolojilerini araştırmaya hazırdır. CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme ile birlikte, hasta iPSC-CM’ler, doğumsal kalp kusurları (CHD’ler)6,7,8dahil olmak üzere CVD’lerin karmaşık genetik temelini anlamak için benzeri görülmemiş bir yol açmıştır. İnsan iPSC-CM’leri ayrıca kalp krizi sırasında hasarlı miyokard doldurmak için otolog hücre kaynakları olarak hizmet etme potansiyelleri sergilemektedir9. Son yıllarda, kardiyak rejenerasyon ve ilaç testi için tanımlanmış alt tiplere (atriyal, ventriküler ve nodal) sahip yüksek kaliteli insan iPSC-CM’leri üretmek çok önemli hale gelmiştir10.
Kardiyak farklılaşma insan iPSC’lerinden son on yılda büyük ölçüde gelişmiştir. Farklılaşma yöntemleri embriyoid cisim (EB) bazlı spontan farklılaşmadan kimyasal olarak tanımlanmış ve yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmaya geçmiştir11. Wnt, BMP, Nodal ve FGF gibi embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan anahtar sinyal molekülleri, insan iPSC’lerinden kardiyomiyosit farklılığını arttırmak için manipüle edilir10,12. Önemli gelişmeler, insan iPSC’lerinden sağlam kardiyomiyosit üretimi için Wnt sinyalinin sıralı modülasyonunu (aktivasyonu ve ardından inhibisyon)içerir 13,14. Endüstriyel ve klinik düzeyde üretime yükseltilme potansiyeline sahipolan 15 , 16dayak kardiyomiyositlerinin büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmak için kimyasal olarak tanımlanmış kardiyak farklılaşma tarifleri araştırılmıştır. Ayrıca, erken insan iPSC-CM’lerinin sağlam genişlemesi, küçük bir kimyasal (CHIR99021)17kullanılarak constitutive Wnt aktivasyonuna maruz kalarak elde edilir. Son zamanlarda, alt tipe özgü kardiyomiyositler, insan iPSC’lerinden kardiyomiyosit soy taahhüdü sırasında belirli farklılaşma pencerelerinde retinoik asit (RA) ve Wnt sinyal yollarının manipülasyonu yoluyla üretilir18,19,20,21,22.
Bu protokolde, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden kaynaklanan insan CD’lerinin sağlam üretimi ve çoğalması için bir çalışma prosedürünü detaylandırıyoruz. 1) insan PBMC’lerinin iPSC’lere yeniden programlanması, 2) insan iPSC’lerinden sağlam dayak kardiyomiyositleri üretimi, 3) erken iPSC-CM’lerin hızlı genişlemesi, 4) insan iPSC-CM’lerin moleküler karakterizasyonu ve 5) insan iPSC-CM’lerin yama kelepçesi ile tek hücreli düzeyde elektrofizyolojik ölçümü için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, hasta kan hücrelerinin dayak kardiyomiyositlerine dönüştürülmesiyle ilgili ayrıntılı deneysel prosedürleri kapsamaktadır.
iPSC yeniden programlanması sırasında, PBMC’leri net çekirdek ve sitoplazma ile genişleyene kadar 1 hafta boyunca kültürlendirmek önemlidir. PBMC’ler çoğalmadığından, viral transdüksiyon için uygun bir hücre numarası başarılı iPSC yeniden programlanması için önemlidir. PBMC’lerin hücre sayısı, enfeksiyonun çokluğu (MOI) ve virüs titresi göz önünde bulundurulmalı ve en uygun transdüksiyon sonuçlarına ulaşacak şekilde ayarlanmalıdır. Kardiyak farklılaşma için, ilk tohumlama yoğun…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA) Kariyer Geliştirme Ödülü 18CDA34110293 (M-T.Z.), Ek Girişimler AVIF ve SVRF ödülleri (M-T.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NHLBI) tarafından desteklendi. 1R01HL132520 ve R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü’nden başlangıç fonlarıyla da desteklendi.
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |