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Neuroscience

Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës

Published: August 11, 2021
doi:
10.3791/62127
, , ,
1Department of Medicine, School of Medicine,Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences,City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics,University of Florida College of Medicine

Summary

Cette méthode introduit une technique simple pour la détection de la libération endogène de monoamine à l’aide de tranches cérébrales aiguës. La configuration utilise une plaque de 48 puits contenant un support de tissu pour la libération de monoamine. La monoamine libérée est analysée par CLHP couplée à une détection électrochimique. De plus, cette technique fournit une méthode de dépistage pour la découverte de médicaments.

Abstract

Les neurotransmetteurs monoamines sont associés à de nombreuses affections neurologiques et psychiatriques. Des modèles animaux de telles conditions ont montré des altérations de la libération de neurotransmetteurs monoamines et de la dynamique d’absorption. Des méthodes techniquement complexes telles que l’électrophysiologie, la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV), l’imagerie, la microdialyse in vivo, l’optogénétique ou l’utilisation de la radioactivité sont nécessaires pour étudier la fonction de la monoamine. La méthode présentée ici est une approche optimisée en deux étapes pour détecter la libération de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës à l’aide d’une plaque de 48 puits contenant des supports de tissu pour examiner la libération de monoamine, et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection électrochimique (HPLC-ECD) pour la mesure de la libération de monoamine. En bref, des coupes cérébrales de rats contenant des régions d’intérêt, y compris le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal, ont été obtenues à l’aide d’un slicer tissulaire ou d’un vibratome. Ces régions d’intérêt ont été disséquées de tout le cerveau et incubées dans un tampon physiologique oxygéné. La viabilité a été examinée tout au long de la période expérimentale, par un essai de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les régions cérébrales disséquées de manière aiguë ont été incubées dans diverses conditions médicamenteuses connues pour induire la libération de monoamine par le transporteur (amphétamine) ou par l’activation de la libération vésiculeuse exocytotique (KCl). Après l’incubation, les produits libérés dans le surnageant ont été collectés et analysés à l’aide d’un système HPLC-ECD. Ici, la libération de monoamine basale est détectée par HPLC à partir de tranches cérébrales aiguës. Ces données corroborent les résultats in vivo et in vitro antérieurs montrant que l’AMPH et le KCl induisent la libération de monoamines. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les mécanismes associés à la libération dépendante du transporteur de monoamine et offre la possibilité de filtrer les composés affectant la libération de monoamine de manière rapide et peu coûteuse.

Introduction

Une pléthore de maladies neurologiques et psychiatriques sont associées à un dérèglement ou à un entretien insuffisant du neurotransmetteur monoamine (dopamine [DA], sérotonine [5-HT], noradrénaline [NE]) homéostasie1,2,3. Ces conditions comprennent, sans toutefois s’y limiter, la dépression1,2, la schizophrénie2, l’anxiété2, la dépendance4, la ménopause5,6,7, la douleur8 et la maladie de Parkinson3. Par exemple, plusieurs modèles de ménopause chez le rat ont montré que le dérèglement ou la réduction des monoamines dans l’hippocampe, le cortex préfrontal et le striatum peut être associé à la dépression et au déclin cognitif, ce qui est observé chez les femmes ménopausées. La dérégulation des monoamines dans ces modèles a été largement examinée à l’aide de HPLC-ECD, bien que les études n’aient pas fait de distinction entre la teneur mesurée en neurotransmetteurs et la libération de neurotransmetteurs5,6,7. Les monoamines sont classiquement libérées dans l’espace extracellulaire par libération vésiculeuse dépendante du Ca2+9 et sont recyclées par leur système de recapture de la membrane plasmique respectif (transporteur de dopamine, DAT; transporteur de sérotonine, SERT; transporteur de noradrénaline, NET)10,11. Inversement, les données suggèrent que ces transporteurs sont capables de libérer ou d’efflux des monoamines, puisque les drogues d’abus telles que l’amphétamine (AMPH) et la 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA) sont connues pour libérer du DA et du 5-HT, respectivement par le biais de leurs systèmes de transport12,13,14,15,16,17 . Ainsi, une bonne compréhension mécaniste de la dynamique de libération de monoamine est cruciale pour développer des pharmacothérapies spécifiques et ciblées.

Un large éventail de techniques ont été utilisées pour étudier la libération de monoamines telles que la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV)18, la microdialyse in vivo13, l’imagerie19, la préincubation avec des monoamines radiomarquées20, l’optogénétique et, plus récemment, les capteurs fluorescents et la photométrie génétiquement codés21,22 . Le FSCV et la microdialyse in vivo sont les principales techniques utilisées pour étudier la libération de monoamines. Le FSCV est utilisé pour étudier la libération exocytotique stimulée de DA principalement dans les tranches cérébrales aiguës et in vivo23. Étant donné que le FSCV utilise des électrodes pour stimuler ou évoquer la libération, la principale source de libération de neurotransmetteurs est la libération vésiculeuse dépendante du Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdialyse in vivo couplée à la CLHP mesure les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires à l’aide d’une sonde placée dans une zone d’intérêt cérébral13,32. Comme pour le FSCV, une limitation majeure de la microdialyse in vivo est la difficulté de déterminer la source de libération de neurotransmetteurs: libération vésiculeuse dépendante de Ca2+ ou dépendante du transporteur. Il convient de noter que les deux méthodes permettent de mesurer directement la libération de monoamine. Grâce aux progrès récents de l’optogénétique, la recherche démontre la détection de la libération de 5-HT et de DA dans un court laps de temps avec une spécificité de type cellulaire exquise21,22. Cependant, ces stratégies nécessitent des techniques et de l’équipement complexes et coûteux, et mesurent indirectement la libération de monoamine, en particulier par la liaison de la monoamine aux récepteurs. En outre, les monoamines radiomarquées sont également utilisées pour étudier la dynamique des monoamines. Les monoamines radiomarquées peuvent être préchargées dans divers systèmes modèles tels que les cellules hétérologues surexprimant chaque transporteur de monoamine20,33,34,35,36,37,38,39,40, les neurones primaires20, les synaptosomes33,39,41, 42, et des tranches de cerveau aiguës43,44. Cependant, la radioactivité présente des dommages potentiels pour l’expérimentateur, et les analytes marqués au tritium peuvent ne pas récapituler fidèlement la dynamique endogène de la monoamine45,46. Les systèmes de superfusion combinés à des méthodes de détection hors ligne telles que HPLC-ECD ont permis la détection de monoamines provenant de sources tissulaires multiples. Ici, ce protocole fournit une méthode optimisée et peu coûteuse, simple et précise utilisant des tranches cérébrales aiguës pour mesurer directement la libération endogène basale et stimulée de monoamine.

Les tranches cérébrales aiguës permettent de tester des hypothèses mécanistes, principalement car elles préservent le microenvironnement anatomique in vivo et maintiennent intactes les synapses47,48,49,50,51,52. Dans quelques études, des tranches cérébrales aiguës ou du tissu cérébral haché ont été utilisés en conjonction avec une technique de superfusion utilisant KCl pour stimuler la libération médiée par Ca2+53,54,55,56. Les systèmes de superfusion ont été essentiels pour faire progresser la compréhension du domaine des mécanismes de libération de neurotransmetteurs, y compris les monoamines. Cependant, ces systèmes sont relativement coûteux et le nombre de chambres disponibles pour l’analyse des tissus varie de 4 à 12. En comparaison, la méthode présentée ici est peu coûteuse, permet la mesure de 48 échantillons de tissus et peut être affinée pour utiliser jusqu’à 96 échantillons de tissus. Chaque puits dans la plaque de 48 puits contient des porte-tissus qui utilisent des filtres pour séparer le produit libéré du tissu, et les monoamines libérées sont ensuite collectées et analysées par HPLC-ECD. Il est important de noter que cette méthode permet de mesurer simultanément la libération de 5-HT, DA et NE de différentes zones du cerveau telles que le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal après traitement avec des agents pharmacologiques qui modulent la libération de monoamine. Ainsi, l’expérimentateur peut répondre à plusieurs questions à l’aide d’un système multi-puits peu coûteux qui augmente le nombre d’échantillons testés et réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Protocol

Toutes les expériences, y compris la manipulation des animaux et la collecte de tissus, ont été menées conformément à l’Université de Floride et au City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), conformément aux protocoles approuvés 201508873 (UF) et 1071 (CCNY). Pour les réactifs et la mémoire tampon, reportez-vous au fichier supplémentaire. 1. Préparez des tranches de cerveau de rat aiguës REMARQUE: Dan…

Representative Results

Cette technique décrit l’utilisation de tranches cérébrales pour mesurer la libération de monoamines endogènes à l’aide de la CLHP avec détection électrochimique basée sur une plaque de 48 puits avec un support de tissu interne. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1 et à la figure 2. Initialement, pour assurer la viabilité des tissus à la fin de l’expérimentation, un essai MTT (3-(4,5-di…

Discussion

Des mesures de libération de monoamine ont été effectuées pendant des années dans un certain nombre de systèmes tels que les cellules hétérologues, les cultures neuronales, les synaptosomes cérébraux, les tranches cérébrales aiguës ex vivo et les animaux entiers13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 </sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions Fondecyt Initiation Fund N 11191049 à J.A.P. et niH grant DA038598 à G.E.T.

Materials

48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer
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References

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Endogenous Monoamine ReleaseBrain SlicesPlate-based AssayDorsal StriatumHippocampusEfflux BufferPharmacological ConditionsVesicular ReleaseTransporter-mediated Release

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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).
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