Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Una pletora di malattie neurologiche e psichiatriche sono associate a disregolazione o insufficiente mantenimento del neurotrasmettitore monoamminico (dopamina [DA], serotonina [5-HT], noradrenalina [NE]) omeostasi1,2,3. Queste condizioni includono, ma non sono limitate a, ^{depressione1,2}, ^{schizofrenia2}, ^ansia2, ^dipendenza4, ^{menopausa5,6,7}, ^dolore8 e morbo di ^Parkinson3. Ad esempio, diversi modelli di menopausa su ratti hanno dimostrato che la disregolazione o la riduzione delle monoammine all’interno dell’ippocampo, della corteccia prefrontale e dello striato può essere associata sia alla depressione che al declino cognitivo, che si osserva nelle donne in menopausa. La disregolazione delle monoammine in questi modelli è stata ampiamente esaminata utilizzando HPLC-ECD, sebbene gli studi non abbiano discriminato tra il contenuto di neurotrasmettitori misurato rispetto al rilascio di neurotrasmettitori5,6,7. Le monoammine vengono rilasciate classicamente nello spazio extracellulare attraverso il rilascio vescicolare ^Ca2+–^dipendente9 e vengono riciclate attraverso il rispettivo sistema di ricaptazione della membrana plasmatica (trasportatore della dopamina, DAT; trasportatore della serotonina, SERT; trasportatore della noradrenalina, NET)^10,11. Al contrario, i dati suggeriscono che questi trasportatori sono in grado di rilasciare o efflussare monoammine, poiché le droghe d’abuso come l’anfetamina (AMPH) e la 3,4-metilendiossimetanfetamina (MDMA) sono note per rilasciare DA e 5-HT, rispettivamente attraverso i loro sistemi di trasporto12,13,14,15,16,17 . Pertanto, una corretta comprensione meccanicistica delle dinamiche di rilascio delle monoammine è cruciale per lo sviluppo di farmacoterapie specifiche e mirate.

Una vasta gamma di tecniche è stata impiegata per studiare il rilascio di monoammine come la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV)¹⁸, la microdialisi in ^vivo13, l’imaging19, la preincubazione con monoammine radiomarcate20, l’optogenetica e, più recentemente, i sensori fluorescenti geneticamente codificati e la fotometria21,22 . FSCV e microdialisi in vivo sono le tecniche primarie utilizzate per studiare il rilascio di monoammine. FSCV è usato per studiare il rilascio esocitotico stimolato di, principalmente, DA in fette cerebrali acute e in ^vivo23. Poiché FSCV utilizza elettrodi per stimolare o evocare il rilascio, la fonte primaria di rilascio di neurotrasmettitori è il rilascio vescicolare ^Ca2+-dipendente18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdialisi in vivo abbinata all’HPLC misura i cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari utilizzando una sonda posizionata in un’area cerebrale di ^{interesse13,32}. Simile a FSCV, una delle principali limitazioni alla microdialisi in vivo è la difficoltà nel determinare la fonte di rilascio del neurotrasmettitore: rilascio vescicolare dipendente da ^{Ca2 +} o trasportatore dipendente. Degno di nota, entrambi i metodi consentono la misurazione diretta del rilascio di monoammina. Attraverso il recente progresso dell’optogenetica, la ricerca dimostra il rilevamento del rilascio di 5-HT e DA in un breve lasso di tempo con una squisita specificità del tipo ^{cellulare21,22}. Tuttavia, queste strategie richiedono tecniche e attrezzature complesse e costose e misurano indirettamente il rilascio di monoammina, in particolare attraverso il legame della monoammina ai recettori. Inoltre, le monoammine radiomarcate sono utilizzate anche per lo studio della dinamica delle monoammine. Le monoammine radiomarcate possono essere precaricate in vari sistemi modello come cellule eterologhe che sovraesprimono ogni trasportatore di monoammine20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuroni ^primari20, sinaptosomi33,39,41^{, 42}, e fette di cervello ^acute43,44. Tuttavia, la radioattività rappresenta un potenziale danno per lo sperimentatore e gli analiti marcati con trizio potrebbero non ricapitolare fedelmente la dinamica endogena delle ^{monoammine45,46}. I sistemi di superfusione combinati con metodi di rilevamento off-line come HPLC-ECD hanno permesso il rilevamento di monoammine da più fonti tissutali. Qui, questo protocollo fornisce come metodo ottimizzato e a basso costo, semplice e preciso utilizzando fette di cervello acute per misurare direttamente il rilascio basale endogeno e stimolato di monoammina.

Le fette di cervello acute consentono di testare ipotesi meccanicistiche, principalmente in quanto preservano il microambiente anatomico in vivo e mantengono intatte le sinapsi47,48,49,50,51,52. In alcuni studi, fette di cervello acute o tessuto cerebrale tritato sono stati utilizzati in combinazione con una tecnica di superfusione che utilizza KCl per stimolare il rilascio mediato da ^{Ca2+53,54,55,56}. I sistemi di superfusione sono stati fondamentali per far progredire la comprensione del campo dei meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori, comprese le monoammine. Tuttavia, questi sistemi sono relativamente costosi e il numero di camere disponibili per l’analisi dei tessuti varia da 4 a 12. In confronto, il metodo qui presentato è economico, consente la misurazione di 48 campioni di tessuto e può essere raffinato per utilizzare fino a 96 campioni di tessuto. Ogni pozzetto all’interno della piastra a 48 pozzetti contiene supporti per tessuti che utilizzano filtri per separare il prodotto rilasciato dal tessuto e le monoammine rilasciate vengono quindi raccolte e analizzate da HPLC-ECD. È importante sottolineare che questo metodo consente la misurazione simultanea del rilascio di 5-HT, DA e NE da diverse aree cerebrali come la corteccia prefrontale, l’ippocampo e lo striato dorsale dopo il trattamento con agenti farmacologici che modulano il rilascio di monoammine. Pertanto, lo sperimentatore può rispondere a più domande utilizzando un sistema multi-pozzo economico che aumenta il numero di campioni testati e quindi riduce il numero di animali utilizzati.