急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

多くの神経疾患および精神疾患は、単アミン神経伝達物質(ドーパミン[DA]、セロトニン[5-HT]、ノルエピネフリン[NE])恒常性^1,2,3の調節不全または不十分な維持に関連している。これらの状態は、うつ病^1、2、統合失調症²、不安²、中毒⁴、更年期^5、6,7、疼痛⁸、およびパーキンソン病³を含むが、これらに限定されない。例えば、更年期のいくつかのラットモデルは、海馬、前頭前野、線条体内のモノアミンの調節不全または減少が、更年期障害を経験している女性に見られるうつ病と認知機能の両方に関連している可能性があることを示している。これらのモデルにおけるモノアミンの調節異常はHPLC-ECDを用いて広範囲に検討されてきたが、この研究は測定された神経伝達物質の含有量と神経伝達^{物質の放出}を区別しなかった^5,6,7.モノアミンは、^Ca2+依存性のvesicular ^release9を介して古典的に細胞外空間に放出され、それぞれの原形質膜再取り込みシステム(ドーパミントランスポーター、DAT;セロトニントランスポーター、SERT;ノルエピネフリントランスポーター、NET)^10,11を介してリサイクルされる。逆に、アンフェタミン(AMPH)や3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA)などの乱用薬がトランスポーターシステムを介してDAおよび5-HTをそれぞれ放出することが知られているため、これらのトランスポーターはモノアミンを放出または流出させ得ることを示唆している^。.したがって、モノアミン放出ダイナミクスの適切な機械学的理解は、特定の標的薬物療法を開発するために重要である。

高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)¹⁸、生体内マイクロダイアルシス¹³、イメージング¹⁹、放射性標識モノアミン²⁰のプレインキュベーション、光遺伝学、さらに最近では遺伝子組み換え蛍光センサーとフォトメトリクス^21,22などのモノアミン放出を研究するために幅広い技術が採用されています^。.FSCVおよび生体内マイクロ透析は、モノアミン放出の研究に使用される主要な技術である。FSCVは、急性脳スライスおよびin ^vivo23におけるDAを中心に刺激された興奮性放出を研究するために使用される。FSCVは電極を使用して放出を刺激または誘発するため、神経伝達物質放出の主な原因は^Ca2+依存性の小胞放出^{18、24、25、26、27、28、29、30、31}である.生体内のミクロジアル症とHPLCを併用すると、関心のある脳領域に配置されたプローブを用いて細胞外神経伝達物質レベルの変化を測定^{する13,32。}FSCVと同様に、生体内のミクロジアルシスに対する大きな制限は、神経伝達物質放出源の決定における困難である:^Ca2+依存性の小胞放出またはトランスポーター依存性である。注目に値する、両方の方法は、モノアミン放出の直接測定を可能にする。光遺伝学の最近の進歩を通じて、研究は、絶妙な細胞型特異性^21,22と短い時間スパンでの5-HTおよびDA放出の検出を実証する。しかし、これらの戦略は、複雑で高価な技術と機器を必要とし、間接的にモノアミン放出を測定し、特に受容体にモノアミン結合を介して。また、放射線標識モノアミンは、モノアミンのダイナミクスの研究にも使用されます。放射性標識モノアミンは、各モノアミントランス^{ポーター20、33、34、35、36}、³⁷、³⁸、³⁹、⁴⁰、一次ニューロン²⁰、シナプトソーム^33、39、41、異種細胞などの様々なモデルシステムにプリロードされ得^る、42、および急性脳スライス^43,44。しかし、放射能は実験者に潜在的な害をもたらし、トリチウム標識された検体は内因性モノアミンダイナミクス^45,46を忠実に再現しない可能性がある。HPLC-ECDなどのオフライン検出法と組み合わせたスーパーフュージョンシステムは、複数の組織源からのモノアミンの検出を可能にしました。ここでは、このプロトコルは、急性脳スライスを使用して、内因性基底および刺激されたモノアミン放出を直接測定するための最適化された低コスト、シンプル、および正確な方法として提供される。

急性脳スライスは、主に生体内の解剖学的微小環境を維持し、無傷のシナプス^{47,48,49,50,51,52}を維持するため、機械学的仮説をテストすることを可能に^する。いくつかの研究では、急性脳スライスまたは切り刻まれた脳組織は、^Ca2+媒介放出53,54,55,56を刺激するためにKClを使用したスーパーフュージョン技術と組み合わせて使用されてきた。超灌流システムは、モノアミンを含む神経伝達物質放出機構の分野の理解を進めるために重要であった。しかし、これらのシステムは比較的高価であり、組織分析に利用可能なチャンバーの数は4〜12の範囲です。これに対し、ここで提示する方法は安価であり、48の組織サンプルの測定を可能にし、そして96までの組織サンプルを使用するように精製され得る。48ウェルプレート内の各ウェルには、フィルターを使用して放出された製品を組織から分離する組織ホルダーが含まれ、放出されたモノアミンをHPLC-ECDによって収集して分析します。重要なことに、この方法は、モノアミン放出を調節する薬理学的薬剤による治療後に、前頭前野、海馬、および後方線条体などの異なる脳領域からの5-HT、DA、およびNE放出の同時測定を可能にする。これにより、実験者は、試験するサンプル数を増加させ、使用する動物の数を減らす安価なマルチウェルシステムを用いて複数の質問に答えることができる。