Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Uma infinidade de doenças neurológicas e psiquiátricas estão associadas à desregulação ou à manutenção insuficiente do neurotransmissor de monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norrepinefrina [NE]) homeostasis1,2,3. Essas condições incluem, mas não se limitam a, ^{depressão1,2}, ^{esquizofrenia2}, ^ansiedade2, ^vício4, ^{menopausa5,6,7}, ^dor8 e doença de ^Parkinson3. Por exemplo, vários modelos de ratos da menopausa mostraram que a desregulação ou redução de monoaminas dentro do hipocampo, córtex pré-frontal e estriato podem estar associados tanto à depressão quanto ao declínio cognitivo, que é visto em mulheres que experimentam a menopausa. A desregulação das monoaminas nesses modelos tem sido extensivamente examinada por meio do HPLC-ECD, embora os estudos não discriminaram o conteúdo medido do neurotransmissor versus a liberação de neurotransmissores5,6,7. As monoaminas são liberadas clássicamente no espaço extracelular através da liberação vesicular dependente de ^Ca2+, ^e são recicladas de volta através de seu respectivo sistema de recaptação de membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)^10,11. Por outro lado, os dados sugerem que esses transportadores são capazes de liberar ou monoaminas efflux, uma vez que drogas de abuso como anfetamina (ANFE) e 3,4-Methylenedioximethamfetamina (MDMA) são conhecidas por liberar DA e 5-HT, respectivamente através de seus sistemas de ^{transporte12,13,} 14,15,16,17 . Assim, uma compreensão mecanicista adequada da dinâmica de liberação de monoaminas é crucial para o desenvolvimento de farmacoterapeias específicas e direcionadas.

Uma ampla gama de técnicas foram empregadas para estudar a liberação de monoaminas como a Voltammetry Ciálica de Varredura Rápida (FSCV)¹⁸, in vivo microdiálise13, ^imagem19, pré-inincubtação com monoaminas radiolabeled20, optogenética e, mais recentemente, sensores fluorescentes geneticamente codificados e ^{fotometria21,22} . A microdiálise FSCV e in vivo são as principais técnicas utilizadas para o estudo da liberação de monoaminas. O FSCV é usado para estudar a liberação exocitomática estimulada de, principalmente, DA em fatias cerebrais agudas e in ^vivo23. Como o FSCV usa eletrodos para estimular ou evocar a liberação, a principal fonte de liberação de neurotransmissores é a liberação vesicular dependente de Ca218,24,25,26,27,28,29,30,31 . A microdiálise in vivo juntamente com o HPLC mede mudanças nos níveis de neurotransmissor extracelular usando uma sonda colocada em uma área cerebral de ^{interesse13,32}. Semelhante ao FSCV, uma grande limitação à microdiálise in vivo é a dificuldade em determinar a fonte de liberação de neurotransmissores: liberação vesicular dependente de ^Ca2+ ou dependente de transporte. Vale ressaltar que ambos os métodos permitem a medição direta da liberação de monoamina. Através do recente avanço da optogenética, pesquisas demonstram a detecção da liberação de 5-HT e DA em um curto espaço de tempo com especificidade requintada do tipo ^celular21,22. No entanto, essas estratégias requerem técnicas e equipamentos complexos e caros, e medem indiretamente a liberação de monoamina, especificamente através da monoamina que liga aos receptores. Além disso, as monoaminas radiolabeladas também são usadas para estudar a dinâmica da monoamina. As monoaminas radiolabeladas podem ser pré-carregadas em vários sistemas de modelo, como células heterólogas que superexpressam cada transporte monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neurônios ^primários20, sinapstos33,39,41^{, 42}, e cortes cerebrais ^agudas43,44. No entanto, a radioatividade representa danos potenciais ao experimentador, e os analitos rotulados com trítio podem não recapitular fielmente a dinâmica endógena da ^{monoamina45,46}. Sistemas de superfusão combinados com métodos de detecção off-line, como o HPLC-ECD, permitiram a detecção de monoaminas de múltiplas fontes de tecido. Aqui, este protocolo fornece como um método otimizado e de baixo custo, simples e preciso usando fatias cerebrais agudas para medir diretamente a liberação de basal endógeno e estimulada.

As fatias cerebrais agudas permitem testar hipóteses mecanicistas, principalmente porque preservam o microambiente anatômico in vivo, e mantêm sinapses intactas47,48,49,50,51,52. Em alguns estudos, fatias cerebrais agudas ou tecido cerebral picado têm sido usados em conjunto com uma técnica de superfusão usando KCl para estimular a liberação mediada ^ca2+53,54,55,56. Os sistemas de superfusão têm sido fundamentais para avançar a compreensão do campo sobre os mecanismos de liberação de neurotransmissores, incluindo as monoaminas. No entanto, esses sistemas são relativamente caros, e o número de câmaras disponíveis para análise de tecidos varia de 4 a 12. Em comparação, o método aqui apresentado é barato, permite a medição de 48 amostras de tecido, podendo ser refinado para usar até 96 amostras de tecido. Cada poço dentro da placa de 48 poços contém suportes de tecido que usam filtros para separar o produto liberado do tecido, e as monoaminas liberadas são então coletadas e analisadas pelo HPLC-ECD. É importante ressaltar que este método permite a medição simultânea de 5-HT, DA e NE de diferentes áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal, o hipocampo e o estriado dorsal após o tratamento com agentes farmacológicos que modulam a liberação de monoamina. Assim, o experimentador pode responder a várias perguntas usando um sistema multi-poço barato que aumenta o número de amostras testadas e, assim, reduzindo o número de animais utilizados.