Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Eine Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen ist mit einer Dysregulation oder unzureichenden Aufrechterhaltung des Monoamin-Neurotransmitters (Dopamin [DA], Serotonin [5-HT], Noradrenalin [NE]) der Homöostase ^{verbunden1,2,3}. Zu diesen Erkrankungen gehören unter anderem ^{Depressionen1,2}, ^{Schizophrenie2}, ^{Angstzustände2}, ^Sucht4, ^{Menopause5,6,7}, ^Schmerzen8 und ^Parkinson3. Zum Beispiel haben mehrere Rattenmodelle der Menopause gezeigt, dass die Dysregulation oder Reduktion von Monoaminen im Hippocampus, im präfrontalen Kortex und im Striatum sowohl mit Depressionen als auch mit kognitivem Verfall verbunden sein kann, was bei Frauen in den Wechseljahren beobachtet wird. Die Dysregulation von Monoaminen in diesen Modellen wurde ausführlich mit HPLC-ECD untersucht, obwohl die Studien nicht zwischen dem gemessenen Neurotransmittergehalt und der Freisetzung von Neurotransmittern ^{unterschieden5,6,7}. Monoamine werden klassischerweise durch ^Ca2+-abhängige vesikuläre ^Freisetzung9 in den extrazellulären Raum freigesetzt und durch ihr jeweiliges Plasmamembran-Wiederaufnahmesystem (Dopamintransporter, DAT; Serotonintransporter, SERT; Noradrenalintransporter, NET) wieder recycelt ^10,11. Umgekehrt deuten die Daten darauf hin, dass diese Transporter in der Lage sind, Monoamine freizusetzen oder auszuströmen, da für Missbrauchsdrogen wie Amphetamin (AMPH) und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) bekannt ist, dass sie DA bzw. 5-HT über ihre Transportersysteme freisetzen12,13,14,15,16,17 . Daher ist ein richtiges mechanistisches Verständnis der Monoaminfreisetzungsdynamik entscheidend für die Entwicklung spezifischer und zielgerichteter Pharmakotherapien.

Zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung wurde eine breite Palette von Techniken eingesetzt, wie z. B. Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)¹⁸, In-vivo-Mikrodialyse13, ^Bildgebung19, Präinkubation mit radioaktiv markierten Monoaminen20, Optogenetik und in jüngerer Zeit genetisch kodierte Fluoreszenzsensoren und ^{Photometrie21,22} . FSCV und In-vivo-Mikrodialyse sind die primären Techniken zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung. FSCV wird verwendet, um die stimulierte exozytotische Freisetzung von hauptsächlich DA in akuten Hirnschnitten und in ^{vivo23 zu untersuchen}. Da FSCV Elektroden verwendet, um die Freisetzung zu stimulieren oder hervorzurufen, ist die primäre Quelle der Freisetzung von Neurotransmittern die ^{Ca2 +}-abhängige vesikuläre Freisetzung18,24,25,26,27,28,29,30,31 . Die In-vivo-Mikrodialyse in Verbindung mit HPLC misst Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitterspiegel mit einer Sonde, die in einem Hirnareal von Interesse platziert ^wird13,32. Ähnlich wie bei FSCV ist eine wesentliche Einschränkung der In-vivo-Mikrodialyse die Schwierigkeit, die Quelle der Neurotransmitterfreisetzung zu bestimmen: ^Ca2+-abhängige vesikuläre Freisetzung oder Transporterabhängigkeit. Bemerkenswert ist, dass beide Methoden die direkte Messung der Monoaminfreisetzung ermöglichen. Durch die jüngste Weiterentwicklung der Optogenetik zeigt die Forschung den Nachweis einer 5-HT- und DA-Freisetzung in kurzer Zeit mit exquisiter Zelltypspezifität21,22. Diese Strategien erfordern jedoch komplexe und kostspielige Techniken und Geräte und messen indirekt die Monoaminfreisetzung, insbesondere durch Monoaminbindung an Rezeptoren. Darüber hinaus werden radioaktiv markierte Monoamine auch zur Untersuchung der Monoamindynamik verwendet. Radioaktiv markierte Monoamine können in verschiedene Modellsysteme vorgeladen werden, wie z.B. heterologe Zellen, die jeden Monoamintransporter überexprimieren20,33,34,35,36,37,38,39,40, primäre Neuronen20, Synaptosomen33,39,41^{, 42} und akute ^{Hirnschnitte43,44}. Radioaktivität stellt jedoch einen potenziellen Schaden für den Experimentator dar, und die tritiummarkierten Analyten rekapitulieren möglicherweise nicht getreu die endogene ^{Monoamindynamik45,46}. Superfusionssysteme in Kombination mit Offline-Nachweismethoden wie HPLC-ECD haben den Nachweis von Monoaminen aus mehreren Gewebequellen ermöglicht. Hier bietet dieses Protokoll als optimierte und kostengünstige, einfache und präzise Methode unter Verwendung akuter Hirnschnitte, um die endogene basale und stimulierte Monoaminfreisetzung direkt zu messen.

Akute Hirnschnitte ermöglichen das Testen mechanistischer Hypothesen, vor allem, da sie die anatomische In-vivo-Mikroumgebung erhalten und intakte Synapsen beibehalten47,48,49,50,51,52. In einigen Studien wurden akute Hirnschnitte oder gehacktes Hirngewebe in Verbindung mit einer Superfusionstechnik verwendet, bei der KCl zur Stimulierung der ^Ca2+-vermittelten Freisetzung ^{verwendet wurde53,54,55,56}. Superfusionssysteme waren entscheidend, um das Verständnis der Freisetzungsmechanismen von Neurotransmittern, einschließlich Monoaminen, voranzutreiben. Diese Systeme sind jedoch relativ teuer, und die Anzahl der für die Gewebeanalyse verfügbaren Kammern reicht von 4 bis 12. Im Vergleich dazu ist die hier vorgestellte Methode kostengünstig, ermöglicht die Messung von 48 Gewebeproben und kann auf bis zu 96 Gewebeproben verfeinert werden. Jede Vertiefung innerhalb der 48-Well-Platte enthält Gewebehalter, die Filter verwenden, um das freigesetzte Produkt vom Gewebe zu trennen, und freigesetzte Monoamine werden dann gesammelt und durch HPLC-ECD analysiert. Wichtig ist, dass diese Methode die gleichzeitige Messung der 5-HT-, DA- und NE-Freisetzung aus verschiedenen Gehirnbereichen wie dem präfrontalen Kortex, dem Hippocampus und dem dorsalen Striatum nach behandlung mit pharmakologischen Wirkstoffen ermöglicht, die die Monoaminfreisetzung modulieren. So kann der Experimentator mehrere Fragen mit einem kostengünstigen Multi-Well-System beantworten, das die Anzahl der getesteten Proben erhöht und dadurch die Anzahl der verwendeten Tiere reduziert.