Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Lignin, bitki hücre duvarlarının hayati yük taşıyan bileşenlerinden biridir ve Dünya’daki en bol ikinci polimerdir^1. Kimyasal olarak, lignin aromatik polimerlerin doğal yenilenebilir kaynağını oluşturan ve biyomalzemelerin sentezini oluşturan yüksek moleküler ağırlıklı karmaşık fenolik bileşiklerden oluşan çapraz bağlı bir heteropolimerdir^2,3. Bu doğal polimer bitki büyümesi, gelişimi, hayatta kalma, mekanik destek, hücre duvarı sertliği, su taşıma, mineral taşıma, konaklama direnci, doku ve organ gelişimi, enerji birikimi ve biyotik ve abiyotik gerilmelerden korunmada önemli roller oynar^4,5,6,7. Lignin öncelikle üç farklı monolignoldan oluşur: fenil propanoid yolundan elde edilen iğne yapraklı, sinapil ve p-coumaryl alkoller^8,9. Lignin miktarı ve monomerlerin bileşimi bitki türlerine, doku / organ tipine ve bitki gelişiminin farklı aşamalarına göre değişir¹⁰. Lignin, kaynak ve monolignol bileşimine göre geniş ölçüde yumuşak ağaç, sertağaç ve çim lignin olarak sınıflandırılır. Softwood öncelikle% 4 p-coumaryl ve% 1 sinapil alkol ile% 95 iğne yapraklı alkolden oluşur. Sertağaç eşit oranlarda iğne yapraklı ve sinapil alkollere sahipken, çim lignin çeşitli oranlarda iğne yapraklı, sinapil ve p-coumaryl alkollerden oluşur^11,12. Monomerlerin bileşimi, hücre duvarının lignin mukavemetini, ayrışmasını ve bozulmasını ve moleküler yapıyı, dallanmayı ve diğer polisakkaritlerle çapraz bağlantıyı belirlediği için kritik öneme sahiptir^13,14.

Lignin araştırmaları, düşük maliyeti ve yüksek bolluğu nedeniyle yiyecek arama, tekstil endüstrileri, kağıt endüstrileri ve biyoetanol, biyoyakıt ve biyo-ürünler için önem kazanmaktadır^15,16. Lignin ölçülmesi için enstrümantal yöntemler (örneğin, yakın kızılötesi (NIR) spektroskopisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve ultraviyole (UV) spektrofotometrisi) ile birlikte çeşitli kimyasal yöntemler (örneğin, asetil bromür, asit deterjanları, Klason ve kalıcı^{oksidasyon)kullanılmıştır.} Lignin analiz yöntemleri genellikle elektromanyetik radyasyon, gravimetri ve çözünürlük esas alınarak sınıflandırılır. Elektromanyetik radyasyonla lignin tahmininin arkasındaki prensip, belirli dalga boylarında ışığı emdiği lignin kimyasal özelliğine dayanıyordu. Bu sonuçlar lignin karbonhidratlardan daha güçlü bir UV emiciliğe sahip olduğu ilkesine dayanarak tahmin edilmiştir. 1962’de Bolker ve Somerville, ahşaptaki lignin içeriğini tahmin etmek için potasyum klorür peletleri kullandılar¹⁸. Bununla birlikte, bu yöntem, lignin olmayan fenolik bileşiklerin varlığı ve uygun bir yok olma katsayısının bulunmaması nedeniyle otsu örneklerden lignin içeriğinin tahmininde sakıncalara sahiptir. 1970 yılında Fergus ve Goring, Guaiacyl ve Şırınil bileşik emilim maksimasının 280 nm ve 270 nm’de olduğunu ve bu sayede Bolker ve Somerville yönteminin yok olma katsayısı sorununu düzelttik^19. Daha sonra, fenolikleri karakterize etmek için son derece hassas bir teknik olan kızılötesi spektroskopi, az miktarda bitki biyokütle örnekleri ile lignin tahmini için de kullanılmıştır. Bu teknolojinin bir örneği, dağınık yansıtıcı Fourier dönüşüm spektrofotometrisiydi. Ancak bu yöntem, UV yöntemine benzer uygun bir standart yok²⁰. Daha sonra lignin içeriği NIRS (kızılötesi spektroskopiye yakın) ve NMR (nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tarafından tahmin edildi. Bununla birlikte, bu yöntemlerde dezavantajlar vardır, lignin kimyasal yapısını değiştirmezler, saflığını^{korurlar 20}.

Gravimetrik Klason yöntemi, odunsu sapların lignin tahmini için doğrudan ve en güvenilir analitik yöntemdir. Gravimetrik lignin tahmininin temeli, lignin olmayan bileşiklerin hidroliz /çözünürlüğü ve gravimetri için çözünmeyen lignin^{toplanmasıdır 21}. Bu yöntemde, karbonhidratlar lignin kalıntısı^20,₂₂çıkarmak için konsantre H 2 SO₄ ile biyokütlenin hidrolizi ile^{çıkarılır.} Bu yöntemle tahmin edilen lignin içeriği asit çözünmeyen lignin veya Klason lignin olarak bilinir. Klason yönteminin uygulanması bitki türüne, doku tipine ve hücre duvarı tipine bağlıdır. Tanenler, polisakkaritler ve proteinler gibi lignin dışı bileşenlerin değişken miktarlarda bulunması, asit çözünmeyen / çözünür lignin içeriğinin tahmininde orantılı farklılıklara neden olur. Bu nedenle, Klason yöntemi sadece odunsu saplar^17,23gibi yüksek lignin içerikli biyokütlenin lignin tahmini için önerilir. Asetil bromür (AcBr), asit çözünmeyen lignin ve tiyoglikolik asit (TGA) gibi çözünürlük yöntemleri, lignin içeriğinin çeşitli bitki biyokütle kaynaklarından tahmin edilmesi için en sık kullanılan yöntemlerdir. Kim ve arkadaşları, çözünerek lignin çıkarılması için iki yöntem belirledi. İlk yöntem lignin çözünmeyen bir kalıntı olarak çözünmeyen bir kalıntı olarak ayıklanırken, ikinci yöntem çözünür fraksiyonda lignin ayırır, çözünmeyen kalıntı olarak selüloz ve hemiselüloz bırakır²⁴.

Çözünürlük esasına dayalı lignin tahmininde kullanılan benzer yöntemler tiyoglikolik asit (TGA) ve asetil bromür (AcBr)^{yöntemleridir 25}. Hem TGA hem de asetil bromür yöntemleri, çözünür lignin emiciliğini 280 nm’de ölçerek lignin içeriğini tahmin ediyor; ancak, AcBr yöntemi lignin çözünürlüğü sürecinde xylans bozulur ve lignin içeriğinde yanlış bir artış gösterir²⁶. Tiyoglikolat (TGA) yöntemi, TGA ile lignin benzil alkol gruplarının tiyoether gruplarıyla spesifik bağlanmaya bağlı olduğu için daha güvenilir bir yöntemdir. TGA bağlı lignin HCl kullanılarak asidik koşullar altında çökelmez ve lignin içeriğinin emiciliği 280 nm²⁷olarak tahmin edilir. TGA yöntemi, daha az yapısal modifikasyon, çözünür bir lignin tahmini şekli, lignin olmayan bileşenlerden daha az parazit ve TGA ile spesifik bağlanma nedeniyle lignin kesin tahmini gibi ek avantajlara sahiptir.

Bu TGA yöntemi, lignin içerik tahmini için kullanılan bitki biyokütle örneğinin türüne göre değiştirilmiştir. Burada, lignin içeriğini tahmin etmek için hızlı TGA pirinç pipetleri²⁷ yöntemini pamuklu dokulara modifiye ettik ve uyarladık. Kısaca, kurutulmuş toz bitki örnekleri proteinleri ve alkol çözünür fraksiyonunu çıkarmak için protein çözünürlüğü tamponuna ve metanol ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Alkol çözünmeyen kalıntısı Asidik koşullarda TGA ve çökelme lignin ile tedavi edildi. Ticari bambu lignin kullanılarak lignin standart eğrisi oluşturulmuş ve bir regresyon çizgisi (y = mx+c) elde edildi. “x” değeri 280 nm’de lignin ortalama emiş değerlerini kullanırken, pamuk bitkisi biyokütle örneklerinde bilinmeyen lignin konsantrasyonunu hesaplamak için regresyon hattından “m” ve “c” değerleri girildi. Bu yöntem beş aşamaya ayrılmıştır: 1) bitki örneklerinin hazırlanması; 2) örnekleri su ve metanol ile yıkamak; 3) pelet TGA ve asit ile tedavi lignin çökeltmek için; 4) lignin yağışı; ve 5) numunenin standart eğri hazırlama ve lignin içeriği tahmini. İlk iki aşama öncelikle bitki malzemesi hazırlamaya ve ardından alkol çözünmeyen malzemeyi elde etmek için su, PSB (protein çözünürlüğü tamponu) ve metanol ekstraksiyonlarına odaklanır. Daha sonra TGA (tiyoglikolik asit) ve HCl ile tedavi edilerek üçüncü fazda lignin ile kompleks oluşturuldu. Sonunda, HCl, emiciliğini 280 nm²⁸olarak ölçmek için sodyum hidroksitte çözünen lignin çökeltmek için kullanıldı.