Estimativa do Teor de Lignina de Biomassa Vegetal usando Ácido Tioglicólico (TGA)

A lignina é um dos componentes vitais de suporte de carga das paredes celulares das plantas e o segundo polímero mais abundante na Terra¹. Quimicamente, a lignina é um heteropolímero transligado composto por compostos fenólicos complexos de alto peso molecular que formam uma fonte renovável natural de polímeros aromáticos e síntese de biomateriais^2,3. Este polímero natural desempenha papéis significativos no crescimento, desenvolvimento, sobrevivência das plantas, suporte mecânico, rigidez da parede celular, transporte de água, transporte mineral, resistência à hospedagem, desenvolvimento de tecidos e órgãos, deposição de energia e proteção contra tensões bióticas e abióticas^4,5,6,7. A lignina é composta principalmente por três monolignols diferentes: álcoois coniferyl, sinapyl e p-coumaryl derivados da via propanoide fenil^8,9. A quantidade de lignina e a composição dos monômeros variam de acordo com as espécies vegetais, do tipo tecido/órgão e de diferentes estágios de desenvolvimento vegetal¹⁰. A lignina é amplamente classificada em madeira macia, madeira e lignina de grama com base na composição de origem e monolignol. A madeira macia é composta principalmente de 95% de álcool coniferyl com 4% p-coumaryl e 1% álcool sinapyl. A madeira de madeira tem álcoois coniferyl e sinapyl em proporções iguais, enquanto a lignina de grama é composta de várias proporções de álcoois coniferyl, sinapyl e p-coumaryl^11,12. A composição dos monômeros é crítica, pois determina a força, decomposição e degradação da parede celular, bem como determina a estrutura molecular, ramificação e crosslinking com outros polissacarídeos^13,14.

A pesquisa da Lignina está ganhando importância no forrageamento, indústrias têxteis, indústrias de papel e para bioetanol, biocombustível e bioprodutos devido ao seu baixo custo e alta abundância^15,16. Vários métodos químicos (por exemplo, brometo de acetil, detergentes ácidos, Klason e oxidação permanganada) juntamente com métodos instrumentais (por exemplo, espectroscopia infravermelha próxima (NIR), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e espectrofotometria ultravioleta (UV) foram utilizados para quantificação de ligrina^9,17. Os métodos de análise da lignina são geralmente classificados com base em radiação eletromagnética, gravimetria e solubilidade. O princípio por trás da estimativa de lignina por radiação eletromagnética foi baseado na propriedade química da lignina pela qual absorve luz em comprimentos de onda específicos. Esses resultados foram estimados com base no princípio de que a lignina tem uma absorção UV mais forte do que os carboidratos. Em 1962, Bolker e Somerville usaram pelotas de cloreto de potássio para estimar o teor de lignina na madeira¹⁸. No entanto, este método tem desvantagens na estimativa do conteúdo de lignina de amostras herbáceas devido à presença de compostos fenólicos não-lignina e à ausência de um coeficiente de extinção adequado. Em 1970, Fergus e Goring descobriram que as máximas de absorção de compostos guaiacicl e seringa estavam em 280 nm e 270 nm, o que corrigiu a questão do coeficiente de extinção do método Bolker e Somerville¹⁹. Posteriormente, a espectroscopia infravermelha, uma técnica altamente sensível para caracterizar fenólicos, também foi utilizada para a estimativa de lignina com uma pequena quantidade de amostras de biomassa vegetal. Um exemplo dessa tecnologia foi a espectrofotometria de transformação de refletidade difusa Fourier. Este método, no entanto, carece de um padrão adequado semelhante ao método UV²⁰. Mais tarde, o teor de lignina foi estimado por NIRS (espectroscopia infravermelha próxima) e NMR (espectroscopia de ressonância magnética nuclear). Porém, há desvantagens nesses métodos, eles não alteram a estrutura química da lignina, mantendo sua pureza²⁰.

O método gravimétrico Klason é um método analítico direto e mais confiável para a estimativa de lignina de caules lenhosos. A base para a estimativa gravimétrica da lignina é a hidrólise/solubilização de compostos não-lignina e a coleta de lignina insolúvel para gravimetria²¹. Neste método, os carboidratos são removidos por hidrólise da biomassa com H₂SO₄ concentrado para extrair resíduo de lignina^20,22. O teor de lignina estimado por este método é conhecido como lignina insolúvel ácida ou lignina klason. A aplicação do método Klason depende da espécie vegetal, do tipo de tecido e do tipo de parede celular. A presença de quantidades variáveis de componentes não-ligninas, como taninos, polissacarídeos e proteínas, resulta em diferenças proporcionais na estimativa do teor de lignina ácida insolúvel/solúvel. Assim, o método Klason só é recomendado para a estimativa de lignina de biomassa de alto teor de lignina, como hastes amadeiradas^17,23. Métodos de solubilidade como brometo de acetil (AcBr), lignina ácida-insolúvel e ácido tioglicólico (TGA) são métodos mais comumente utilizados para a estimativa do conteúdo de lignina de várias fontes de biomassa vegetal. Kim et al. estabeleceram dois métodos para extração de lignina por solubilização. O primeiro método extrai a lignina como um resíduo insolúvel solubilizando a celulose e a hemiccelulose, enquanto o segundo método separa a lignina na fração solúvel, deixando a celulose e a hemicellulose como o resíduo insolúvel²⁴.

Métodos semelhantes empregados na estimativa de lignina com base na solubilidade são os métodos de ácido tioglicólico (TGA) e brometo de acetil (AcBr)²⁵. Tanto os métodos de TGA quanto de brometo acetil estimam o teor de lignina medindo a absorção da lignina solubilizada a 280 nm; no entanto, o método AcBr degrada xilanas durante o processo de solubilização da lignina e mostra um falso aumento no teor de lignina²⁶. O método de tioglicolato (TGA) é o método mais confiável, pois depende de uma ligação específica com os outros grupos de álcool benzílico de lignina com TGA. A lignina vinculada à TGA é precipitada sob condições ácidas usando HCl, e o teor de lignina é estimado usando sua absorvância em 280 nm²⁷. O método TGA tem vantagens adicionais de modificações menos estruturais, uma forma solúvel de estimativa de lignina, menor interferência de componentes não-ligninas e estimativa precisa de lignina devido à ligação específica com a TGA.

Este método TGA é modificado com base no tipo de amostra de biomassa vegetal usada para a estimativa de teor de lignina. Aqui, modificamos e adaptamos o método rápido TGA de canudos de arroz²⁷ para tecidos de algodão para estimar o teor de lignina. Resumidamente, as amostras de plantas secas em pó foram submetidas a tampão de solubilização de proteínas e extração de metanol para remover proteínas e a fração solúvel do álcool. O resíduo insolúvel de álcool foi tratado com TGA e lignina precipitada em condições ácidas. Foi gerada uma curva padrão de lignina utilizando-se uma lignina comercial de bambu e uma linha de regressão (y = mx+c). O valor “x” utiliza valores médios de absorção de lignina a 280 nm, enquanto os valores “m” e “c” foram inseridos a partir da linha de regressão para calcular a concentração de lignina desconhecida em amostras de biomassa vegetal de algodão. Este método é dividido em cinco fases: 1) preparação de amostras de plantas; 2) lavar as amostras com água e metanol; 3) tratamento da pelota com TGA e ácido para precipitar a lignina; 4) precipitação de lignina; e 5) a preparação padrão da curva e a estimativa de teor de lignina da amostra. As duas primeiras fases são focadas principalmente na preparação do material vegetal, seguidas de extrações de água, PSB (tampão de solubilização de proteínas) e metanol para obtenção do material insolúvel de álcool. Em seguida, foi tratado com TGA (ácido tioglicólico) e HCL para formar um complexo com lignina na terceira fase. No final, o HCL foi usado para precipitar a lignina, que foi dissolvida em hidróxido de sódio para medir sua absorvência em 280 nm²⁸.