Stima del contenuto di Lignina da biomassa vegetale mediante acido tioglicolico (TGA)

La lignina è uno dei componenti portanti vitali delle pareti cellulari delle piante e il secondo polimero più abbondante sulla Terra¹. Chimicamente, la lignina è un eteropolimero reticolato costituito da composti fenolici complessi ad alto peso molecolare che formano una fonte rinnovabile naturale di polimeri aromatici e sintesi di biomateriali^2,3. Questo polimero naturale svolge ruoli significativi nella crescita delle piante, nello sviluppo, nella sopravvivenza, nel supporto meccanico, nella rigidità delle pareti cellulari, nel trasporto dell’acqua, nel trasporto di minerali, nella resistenza all’alloggio, nello sviluppo di tessuti e organi, nella deposizione di energia e nella protezione da stress biotici e^{abiotici 4,5,6,7}. La lignina è composta principalmente da tre diversi monoligoli: coniferile, sinapil e alcoli p-coumarili derivati dalla via fenil propanoide^8,9. La quantità di lignina e la composizione dei monomeri variano in base alle specie vegetali, al tipo di tessuto / organo e alle diverse fasi dello sviluppo delle piante¹⁰. La lignina è ampiamente classificata in legno tenero, legno duro e lignina d’erba basata sulla composizione della sorgente e del monolignolo. Il legno tenero è composto principalmente dal 95% di alcol di coniferile con il 4% di p-coumaryl e l’1% di alcoli sinapilici. Il legno duro ha alcoli di coniferile e sinapil in proporzioni uguali, mentre la lignina erba è composta da varie proporzioni di alcoli di coniferile, sinapile e p-coumaryl^11,12. La composizione dei monomeri è critica in quanto determina la forza della lignina, la decomposizione e la degradazione della parete cellulare, nonché determina la struttura molecolare, la ramificazione e il collegamento incrociato con altri polisaccaridi^13,14.

La ricerca sulla lignina sta acquisendo importanza nel foraggiamento, nell’industria tessile, nell’industria della carta e per il bioetanolo, i biocarburanti e i bio-prodotti a causa del suo basso costo^{e dell’elevata abbondanza 15,16}. Vari metodi chimici (ad esempio, bromuro di acetile, detergenti acidi, ossidazione di Klason e permanganato) insieme a metodi strumentali (ad esempio, spettroscopia del vicino infrarosso (NIR), spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrofotometria ultravioletta (UV) sono stati utilizzati per la quantificazione della lignina^9,17. I metodi di analisi della lignina sono generalmente classificati in base alla radiazione elettromagnetica, alla gravimetria e alla solubilità. Il principio alla base della stima della lignina mediante radiazione elettromagnetica era basato sulla proprietà chimica della lignina con cui assorbe la luce a lunghezze d’onda specifiche. Questi risultati sono stati stimati in base al principio che la lignina ha una maggiore assorbanza UV rispetto ai carboidrati. Nel 1962, Bolker e Somerville usavano pellet di cloruro di potassio per stimare il contenuto di lignina nel legno¹⁸. Tuttavia, questo metodo presenta inconvenienti nella stima del contenuto di lignina provenienti da campioni erbacei a causa della presenza di composti fenolici non lignina e dell’assenza di un adeguato coefficiente di estinzione. Nel 1970, Fergus e Goring scoprirono che i massimi di assorbimento del composto guaiacyl e siringile erano a 280 nm e 270 nm, il che corresse la questione del coefficiente di estinzione del metodo¹⁹di Bolker e Somerville. Successivamente, la spettroscopia infrarossa, una tecnica altamente sensibile per caratterizzare i fenolici, è stata utilizzata anche per la stima della lignina con una piccola quantità di campioni di biomassa vegetale. Un esempio di tale tecnologia era la spettrofotometria di trasformazione di Fourier a riflessione diffusa. Questo metodo, tuttavia, manca di uno standard adeguato simile al metodo UV²⁰. Successivamente, il contenuto di lignina è stato stimato da NIRS (spettroscopia vicino all’infrarosso) e NMR (spettroscopia di risonanza magnetica nucleare). Tuttavia, ci sono svantaggi in questi metodi, non alterano la struttura chimica della lignina, mantenendo la sua purezza²⁰.

Il metodo gravimetrico klason è un metodo analitico diretto e più affidabile per la stima della lignina degli steli legnosi. La base per la stima gravimetrica della lignina è l’idrolisi/solubilizzazione di composti non lignina e la raccolta di lignina insolubile per la gravimetria²¹. In questo metodo, i carboidrati vengono rimossi per idrolisi della biomassa con H₂SO_{4 concentrato per estrarre} il residuo di lignina^20,22. Il contenuto di lignina stimato con questo metodo è noto come lignina acida insolubile o lignina di Klason. L’applicazione del metodo Klason dipende dalle specie vegetali, dal tipo di tessuto e dal tipo di parete cellulare. La presenza di quantità variabili di componenti non lignina come tannini, polisaccaridi e proteine, si traduce in differenze proporzionali nella stima del contenuto di lignina acida insolubile/solubile. Pertanto, il metodo Klason è raccomandato solo per la stima della lignina della biomassa ad alto contenuto di lignina come gli steli legnosi^17,23. I metodi di solubilità come il bromuro di acetile (AcBr), la lignina insolubile con acido e l’acido tioglicolico (TGA) sono metodi più comunemente usati per stimare il contenuto di lignina da varie fonti di biomassa vegetale. Kim et al. Il primo metodo estrae la lignina come residuo insolubile solubilizzando la cellulosa e l’emicellulosa, mentre il secondo metodo separa la lignina nella frazione solubile, lasciando la cellulosa e l’emicellulosa come residuo insolubile²⁴.

Metodi analoghi utilizzati nella stima della lignina in base alla solubilità sono i metodi dell’acido tioglicolico (TGA) e del bromuro di acetile (AcBr)²⁵. Sia il TGA che il bromuro di acetile stimano il contenuto di lignina misurando l’assorbanza della lignina solubilizzata a 280 nm; Tuttavia, il metodo AcBr degrada gli xilulici durante il processo di solubilizzazione della lignina e mostra un falso aumento del contenuto di lignina²⁶. Il metodo tioglicolato (TGA) è il metodo più affidabile, in quanto dipende da un legame specifico con i gruppi tioether di gruppi di alcole benzile di lignina con TGA. La lignina legata al TGA viene precipitata in condizioni acide utilizzando HCl e il contenuto di lignina è stimato utilizzando la sua assorbanza a 280 nm²⁷. Il metodo TGA presenta ulteriori vantaggi di meno modifiche strutturali, una forma solubile di stima della lignina, meno interferenze da componenti non di lignina e una stima precisa della lignina dovuta a un legame specifico con la TGA.

Questo metodo TGA viene modificato in base al tipo di campione di biomassa vegetale utilizzato per la stima del contenuto di lignina. Qui, abbiamo modificato e adattato il metodo TGA rapido delle cannucce di riso²⁷ ai tessuti di cotone per stimare il contenuto di lignina. In breve, i campioni di piante in polvere essiccati sono stati sottoposti a tampone di solubilizzazione proteica ed estrazione di metanolo per rimuovere le proteine e la frazione solubile in alcool. Il residuo insolubile di alcol è stato trattato con TGA e lignina precipitata in condizioni acide. Una curva standard di lignina è stata generata usando lignina di bambù commerciale ed è stata ottenuta una linea di regressione (y = mx+c). Il valore “x” utilizza valori medi di assorbanza della lignina a 280 nm, mentre i valori “m” e “c” sono stati inseriti dalla linea di regressione per calcolare la concentrazione sconosciuta di lignina in campioni di biomassa delle piante di cotone. Questo metodo è diviso in cinque fasi: 1) preparazione di campioni vegetali; 2) lavare i campioni con acqua e metanolo; 3) trattamento del pellet con TGA e acido per far precipitare la lignina; 4) precipitazione della lignina; 5) la preparazione standard della curva e la stima del contenuto di lignina del campione. Le prime due fasi si concentrano principalmente sulla preparazione del materiale vegetale seguita da acqua, PSB (tampone di solubilizzazione proteica) ed estrazioni di metanolo per ottenere il materiale insolubile alcool. Quindi, è stato trattato con TGA (acido tioglicolico) e HCl per formare un complesso con lignina nella terza fase. Alla fine, l’HCl è stato utilizzato per precipitare la lignina, che è stata sciolta in idrossido di sodio per misurarne l’assorbanza a 280 nm²⁸.