Schatting van het ligninegehalte van plantaardige biomassa met thioglycolzuur (TGA)

Lignine is een van de vitale dragende componenten van plantencelwanden en het op een na meest voorkomende polymeer op aarde¹. Chemisch is lignine een gekruist heteropolymeer dat bestaat uit complexe fenolverbindingen met een hoog molecuulgewicht die een natuurlijke hernieuwbare bron vormen van aromatische polymeren en synthese van biomaterialen^2,3. Dit natuurlijke polymeer speelt een belangrijke rol in plantengroei, ontwikkeling, overleving, mechanische ondersteuning, stijfheid van de celwand, watertransport, mineraaltransport, verblijfsweerstand, weefsel- en orgaanontwikkeling, afzetting van energie en bescherming tegen biotische en abiotische^{spanningen 4,5,6,7}. Lignine bestaat voornamelijk uit drie verschillende monolignolen: coniferyl, sinapyl en p-coumarylalcoholen die zijn afgeleid van de fenyl propanoïde route^8,9. De hoeveelheid lignine en de samenstelling van monomeren variëren afhankelijk van de plantensoort, het weefsel/orgaantype en verschillende stadia van plantenontwikkeling¹⁰. Lignine is grofweg ingedeeld in zachthout, hardhout en graslignine op basis van de samenstelling van de bron en monolignol. Zachthout bestaat voornamelijk uit 95% coniferylalcohol met 4% p-coumaryl en 1% sinapylalcoholen. Hardhout heeft coniferyl- en sinapylalcoholen in gelijke verhoudingen, terwijl graslignine bestaat uit verschillende verhoudingen coniferyl-, sinapyl- en p-coumarylalcoholen^11,12. De samenstelling van monomeren is van cruciaal belang omdat het de ligninesterkte, afbraak en afbraak van de celwand bepaalt, evenals het bepalen van de moleculaire structuur, vertakking en kruiskoppeling met andere polysachariden^13,14.

Lignine onderzoek wint aan belang in foerageren, textielindustrieën, papierindustrieën, en voor bio-ethanol, biobrandstof, en bio-producten als gevolg van de lage kosten en hoge overvloed^15,16. Verschillende chemische methoden (bijv. acetylbromide, zure detergenten, Klason en permanganaatoxidatie) samen met instrumentele methoden (bijv. near infrared (NIR) spectroscopie, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopie en ultraviolette (UV) spectrofotometrie) werden gebruikt voor ligninekwantificering^9,17. De analysemethoden van lignine worden over het algemeen geclassificeerd op basis van elektromagnetische straling, gravimetrie en oplosbaarheid. Het principe achter lignine schatting door elektromagnetische straling was gebaseerd op de chemische eigenschap van lignine waarmee het licht absorbeert op specifieke golflengten. Deze resultaten werden geschat op basis van het principe dat lignine een sterkere UV-absorptie heeft dan koolhydraten. In 1962 gebruikten Bolker en Somerville kaliumchloridekorrels om het ligninegehalte in hout te schatten¹⁸. Deze methode heeft echter nadelen bij de schatting van het ligninegehalte uit kruidachtige monsters als gevolg van de aanwezigheid van fenolverbindingen zonder lignine en het ontbreken van een geschikte extinctiecoëfficiënt. In 1970 ontdekten Fergus en Goring dat de absorptiemaxima van guaiacyl en syringylverbinding 280 nm en 270 nm bedroegen, wat de uitstervingscoëfficiënt van de Bolker- en Somerville-methode¹⁹corrigeerde. Later werd infraroodspectroscopie, een zeer gevoelige techniek voor het karakteriseren van fenolen, ook gebruikt voor lignineschatting met een kleine hoeveelheid biomassamonsters van planten. Een voorbeeld van dergelijke technologie was diffuse reflectie Fourier transform spectrofotometrie. Deze methode mist echter een goede standaard die vergelijkbaar is met de UV-methode²⁰. Later werd het ligninegehalte geschat door NIRS (near infrared spectroscopy) en NMR (nuclear magnetic resonance spectroscopy). Hoewel er nadelen zijn aan deze methoden, veranderen ze de chemische structuur van lignine niet, met behoud van de zuiverheid²⁰.

De gravimetrische Klason-methode is een directe en de meest betrouwbare analysemethode voor lignineschatting van houtachtige stengels. De basis voor gravimetrische lignineschatting is de hydrolyse/solubilisatie van niet-lignineverbindingen en de verzameling van onoplosbare lignine voor gravimetrie²¹. Bij deze methode worden de koolhydraten verwijderd door hydrolyse van de biomassa met geconcentreerd H₂SO₄ om lignineresidu^20,22te extraheren . Het ligninegehalte dat met deze methode wordt geschat, staat bekend als zure onoplosbare lignine of Klason lignine. De toepassing van de Klason-methode hangt af van de plantensoort, het weefseltype en het celwandtype. De aanwezigheid van variabele hoeveelheden niet-ligninecomponenten zoals tannines, polysachariden en eiwitten resulteert in proportionele verschillen in de schatting van het gehalte aan zure onoplosbare/oplosbare lignine. Daarom wordt de Klason-methode alleen aanbevolen voor lignineschatting van biomassa met een hoog ligninegehalte, zoals houtachtige stengels^17,23. Oplosbaarheidsmethoden zoals acetylbromide (AcBr), zuuroplosbare lignine en thioglycolzuur (TGA) zijn de meest gebruikte methoden voor het schatten van het ligninegehalte uit verschillende plantaardige biomassabronnen. Kim et al. stelden twee methoden vast voor lignine-extractie door solubilisatie. De eerste methode extraheert lignine als onoplosbaar residu door cellulose en hemicellulose te oplosbaar te maken, terwijl de tweede methode lignine in de oplosbare fractie scheidt, waardoor cellulose en hemicellulose als onoplosbaar residu^{achterblijven 24}.

Vergelijkbare methoden die worden gebruikt bij de schatting van lignine op basis van de oplosbaarheid zijn thioglycolzuur (TGA) en acetylbromide (AcBr) methoden²⁵. Zowel TGA- als acetylbromidemethoden schatten het ligninegehalte door de absorptie van de solubiliseerde lignine te meten op 280 nm; de AcBr-methode degradeert echter xylanen tijdens het proces van lignine-solubilisatie en vertoont een valse toename van het ligninegehalte²⁶. De thioglycolaatmethode (TGA) is de betrouwbaardere methode, omdat deze afhankelijk is van specifieke binding met de thioethergroepen van benzylalcoholgroepen lignine met TGA. De TGA-gebonden lignine wordt onder zure omstandigheden neergeslagen met behulp van HCl en het ligninegehalte wordt geschat met behulp van zijn absorptie op 280 nm²⁷. De TGA-methode heeft extra voordelen van minder structurele modificaties, een oplosbare vorm van lignineschatting, minder interferentie van niet-ligninecomponenten en nauwkeurige schatting van lignine als gevolg van specifieke binding met TGA.

Deze TGA-methode wordt gewijzigd op basis van het soort biomassamonster van de installatie dat wordt gebruikt voor de schatting van het ligninegehalte. Hier hebben we de snelle TGA-methode van rijststro’s²⁷ aangepast aan katoenweefsels om het ligninegehalte te schatten. Kortom, de gedroogde gepoederde plantenmonsters werden onderworpen aan eiwitoplosbaarheidsbuffer en methanolextractie om eiwitten en de op alcohol oplosbare fractie te verwijderen. Het alcoholonoplosbare residu werd behandeld met TGA en geprecipiteerde lignine onder zure omstandigheden. Een lignine standaard curve werd gegenereerd met behulp van commerciële bamboe lignine en een regressie lijn (y = mx+c) werd verkregen. De “x”-waarde gebruikt gemiddelde absorptiewaarden van lignine bij 280 nm, terwijl “m” en “c”-waarden werden ingevoerd uit de regressielijn om de onbekende lignineconcentratie in biomassamonsters van katoenfabrieken te berekenen. Deze methode is verdeeld in vijf fasen: 1) bereiding van plantenmonsters; 2) het wassen van de monsters met water en methanol; 3) behandeling van de pellet met TGA en zuur om lignine neer te doen; 4) neerslag van lignine; en 5) de standaardcurvevoorbereiding en de schatting van het ligninegehalte van het monster. De eerste twee fasen zijn voornamelijk gericht op de bereiding van plantaardig materiaal, gevolgd door water, PSB (eiwitoplosbaarheidsbuffer) en methanolextracties om het onoplosbare alcoholmateriaal te verkrijgen. Vervolgens werd het behandeld met TGA (thioglycolzuur) en HCl om in de derde fase een complex met lignine te vormen. Aan het einde werd HCl gebruikt om lignine neer te doen, dat werd opgelost in natriumhydroxide om de absorptie ervan te meten bij 280 nm²⁸.