הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

ליגנין הוא אחד המרכיבים החיוניים לשאת עומס של קירות תא הצמח ואת הפולימר השני הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ¹. מבחינה כימית, ליגנין הוא הטרופולימר מקושר המורכב מתרכובות פנוליות מורכבות משקל מולקולרי גבוה היוצרות מקור מתחדש טבעי של פולימרים ארומטיים וסינתזה של ביו-חומרים^2,3. פולימר טבעי זה ממלא תפקידים משמעותיים בצמיחת הצמח, פיתוח, הישרדות, תמיכה מכנית, קשיחות דופן התא, הובלת מים, הובלת מינרלים, עמידות ללינה, פיתוח רקמות ואיברים, תצהיר אנרגיה והגנה מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים^4,5,6,7. ליגנין מורכב בעיקר משלושה מונוליגנולים שונים: מחט, סינפיל ואלכוהול p-coumaryl הנגזרים ממסלול פניל פרופנואיד^8,9. כמות ליגנין ואת הרכב של מונומרים להשתנות בהתאם למין הצמח, סוג הרקמה / איבר, ושלבים שונים של התפתחות הצמח¹⁰. ליגנין מסווג באופן נרחב לעץ רך, עץ קשה, ודשא ליגנין מבוסס על הרכב המקור מונוליניול. עץ רך מורכב בעיקר מ-95% אלכוהול מחטני עם 4% p-coumaryl ו-1% אלכוהול סינפיל. בעץ יש אלכוהול מחט וסינפיל בפרופורציות שוות, ואילו ליגנין דשא מורכב מממדים שונים של מחט, סינפיל ואלכוהול p-coumaryl^11,12. ההרכב של מונומרים הוא קריטי כפי שהוא קובע את כוח ליגנין, פירוק, השפלה של דופן התא, כמו גם קביעת מבנה מולקולרי, הסתעפות, הצלבה עם פוליסכרידים אחרים^13,14.

מחקר ליגנין הוא צובר חשיבות ליקוט, תעשיות טקסטיל, תעשיות נייר, עבור bioethanol, דלק ביולוגי, ביו מוצרים בשל עלות נמוכה שלה שפע גבוה^15,16. שיטות כימיות שונות (למשל, אצטיל ברומיד, חומרי ניקוי חומצה, קלסון, חמצון פרמנגנט) יחד עם שיטות אינסטרומנטליות (למשל, ליד אינפרא אדום (NIR) ספקטרוסקופיה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, ו ספקטרופוטומיה אולטרה סגולה (UV) שימשו לכימות ליגנין^9,17. שיטות הניתוח של ליגנין מסווגות בדרך כלל בהתבסס על קרינה אלקטרומגנטית, כבידה, ומסיסות. העיקרון מאחורי הערכת ליגנין על ידי קרינה אלקטרומגנטית התבסס על המאפיין הכימי של ליגנין שבאמצעותו הוא סופג אור באורכי גל ספציפיים. תוצאות אלו הוערכו בהתבסס על העיקרון כי ליגנין יש ספיגת UV חזקה יותר מאשר פחמימות. בשנת 1962, בולקר וסומרוויל השתמשו כדורי אשלגן כלורי כדי להעריך את תכולת ליגנין בעץ¹⁸. עם זאת, שיטה זו יש חסרונות בהערכת תוכן ליגנין מדגימות עשבוניות בשל נוכחותם של תרכובות פנוליות שאינן ליגנין והיעדר מקדם הכחדה מתאים. בשנת 1970, פרגוס וגרינג מצאו כי גואיאצ’יל ומתחם סירינגיל ספיגת מקסימום היו ב 280 ננומטר ו 270 ננומטר, אשר תיקן את נושא מקדם ההכחדה של שיטת בולקר וסומרוויל¹⁹. מאוחר יותר, ספקטרוסקופיית אינפרא אדום, טכניקה רגישה מאוד לאפיון פנולים, שימש גם להערכת ליגנין עם כמות קטנה של דגימות ביומסה צמחית. דוגמה אחת לטכנולוגיה כזו הייתה ספקטרופוטומיית שינוי פורייה מפוזרת. שיטה זו, לעומת זאת, חסר תקן מתאים דומה לשיטת UV²⁰. מאוחר יותר, התוכן ליגנין הוערך על ידי NIRS (ליד ספקטרוסקופיה אינפרא אדום) ו NMR (ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית). אמנם, ישנם חסרונות בשיטות אלה, הם לא משנים את המבנה הכימי של ליגנין, שמירה על^{טוהר שלה 20}.

שיטת קלאסון הכבידתית היא שיטה אנליטית ישירה ואמינה ביותר להערכת ליגנין של גבעולים עציים. הבסיס להערכת ליגנין כבידתי הוא הידרוליזה / solubilization של תרכובות שאינן ליגנין ואוסף של ליגנין מסיסים עבור gravimetry²¹. בשיטה זו, הפחמימות מוסרות על ידי הידרוליזה של ביומסה עם מרוכז H₂SO₄ כדי לחלץ שאריות ליגנין^20,22. תכולת הינין המוערכת בשיטה זו ידועה בשם ליגנין בלתי מסיס חומצי או ליגנין קלסון. היישום של שיטת קלסון תלוי במיני הצמחים, בסוג הרקמה ובסוג דופן התא. נוכחות של כמויות משתנות של רכיבים שאינם ליגנין כגון טאנינים, פוליסכרידים וחלבונים, גורמת להבדלים פרופורציונליים בהערכת תכולת ליגנין מסיס/מסיס בחומצה. לפיכך, שיטת קלסון מומלץ רק להערכת ליגנין של ביומסה תוכן ליגנין גבוהה כגון גבעולים וודי^17,23. שיטות מסיסות כגון אצטיל ברומיד (AcBr), ליגנין מסיס בחומצה, וחומצה תיוגליקולית (TGA) הן השיטות הנפוצות ביותר להערכת תכולת הליגנין ממקורות ביומסה צמחיים שונים. קים ואח ‘ הקימו שתי שיטות להפקת ליגנין על ידי solubilization. השיטה הראשונה מחלצת ליגנין כשאריות בלתי מסיסות על ידי תאית solubilizing ו hemicellulose, בעוד השיטה השנייה מפרידה ליגנין בשבר מסיס, משאיר תאית hemicellulose כמו שאריות^{מסיסים 24}.

שיטות דומות המשמשות להערכת ליגנין המבוססות על המסיסות הן חומצה תיוגליקולית (TGA) ושיטות אצטיל ברומיד (AcBr)²⁵. שתי שיטות TGA ואצטיל ברומיד להעריך את התוכן ליגנין על ידי מדידת הספיגה של ליגנין solubilized ב 280 ננומטר; עם זאת, שיטת AcBr משפילה xylans במהלך תהליך של ליגנין solubilization ומראה עלייה כוזבת בתוכן ליגנין²⁶. שיטת thioglycolate (TGA) היא השיטה האמינה יותר, שכן היא תלויה מליטה ספציפית עם קבוצות thioether של קבוצות אלכוהול בנזיל של ליגנין עם TGA. ליגנין TGA מאוגד הוא זירז בתנאים חומציים באמצעות HCl, ואת התוכן ליגנין מוערך באמצעות ספיגה שלה ב 280 ננומטר²⁷. לשיטת TGA יתרונות נוספים של פחות שינויים מבניים, צורה מסיסת של הערכת ליגנין, פחות הפרעות מרכיבים שאינם ליגנין, והערכת ליגנין מדויקת עקב מליטה ספציפית עם TGA.

שיטת TGA זו משתנה בהתבסס על סוג של מדגם ביומסה צמח המשמש להערכת תוכן ליגנין. כאן, שינינו והתאמנו את שיטת TGA המהירה של קשיות אורז²⁷ לרקמות כותנה כדי להעריך את תכולת הליגינין. בקצרה, דגימות הצמח אבקת מיובשים היו נתונים מאגר solubilization חלבון מיצוי מתנול כדי להסיר חלבונים ואת החלק מסיס אלכוהול. שאריות אלכוהול מסיסות טופלו עם TGA ו lignin מזורז בתנאים חומציים. עקומת תקן ליגנין נוצרה באמצעות ליגנין במבוק מסחרי וקו רגרסיה (y = mx +c) הושג. הערך “x” משתמש בערכי ספיגה ממוצעים של ליגנין ב- 280 ננומטר, בעוד שערכי “m” ו- “c” הוזנו מקו הרגרסיה כדי לחשב ריכוז ליגנין לא ידוע בדגימות ביומסה של צמח כותנה. שיטה זו מחולקת לחמישה שלבים: 1) הכנת דגימות צמחים; 2) לשטוף את הדגימות עם מים ומתנול; 3) טיפול של גלולה עם TGA וחומצה כדי לזרז ליגנין; 4) משקעים של ליגנין; ו -5) הכנת העקומה הסטנדרטית והערכת תוכן ליגנין של המדגם. שני השלבים הראשונים מתמקדים בעיקר בהכנת חומר צמחי ואחריו מים, PSB (חיץ סולוביליזציה של חלבונים) ועקירות מתנול כדי להשיג את החומר מסיס באלכוהול. לאחר מכן, הוא טופל עם TGA (חומצה תיוגליקולית) ו HCl כדי ליצור קומפלקס עם ליגנין בשלב השלישי. בסוף, HCl שימש לזרז ליגנין, אשר מומס נתרן הידרוקסיד כדי למדוד את ספיגתו ב 280 ננומטר²⁸.