Abschätzung des Ligningehalts von pflanzlicher Biomasse mit Thioglykolsäure (TGA)

Lignin ist eine der lebenswichtigen tragenden Komponenten pflanzlicher Zellwände und das zweithäufigste Polymer auf der Erde¹. Chemisch ist Lignin ein vernetztes Heteropolymer, das aus hochmolekularen komplexen phenolischen Verbindungen besteht, die eine natürliche erneuerbare Quelle aromatischer Polymere und die Synthese von Biomaterialien bilden^2,3. Dieses natürliche Polymer spielt eine wichtige Rolle bei Pflanzenwachstum, Entwicklung, Überleben, mechanischer Unterstützung, Zellwandsteifigkeit, Wassertransport, Mineraltransport, Unterbringungsresistenz, Gewebe- und Organentwicklung, Energieablagerung und Schutz vor biotischen und abiotischen Belastungen^4,5,6,7. Lignin besteht hauptsächlich aus drei verschiedenen Monolignolen: Coniferyl-, Sinapyl- und p-Cumarinalkohole, die aus dem Phenylpropanoidweg^8,9abgeleitet sind . Die Menge an Lignin und die Zusammensetzung der Monomere variieren je nach Pflanzenart, Gewebe- / Organtyp und verschiedenen Stadien der Pflanzenentwicklung¹⁰. Lignin wird grob in Nadelholz, Hartholz und Graslignin klassifiziert, basierend auf der Quelle und der Monolignolzusammensetzung. Nadelholz besteht hauptsächlich aus 95% Coniferylalkohol mit 4% p-Cumarin und 1% Sinapylalkoholen. Laubholz hat Nadel- und Sinapylalkohole in gleichen Anteilen, während Gras lignin aus verschiedenen Anteilen von Coniferyl-, Sinapyl- und p-Cumarinalkoholen^{besteht 11,12}. Die Zusammensetzung der Monomere ist entscheidend, da sie die Ligninstärke, den Abbau und den Abbau der Zellwand bestimmt sowie die molekulare Struktur, Verzweigung und Vernetzung mit anderen Polysacchariden^{bestimmt 13,14}.

Die Ligninforschung gewinnt aufgrund ihrer niedrigen Kosten und hohen Häufigkeit an Bedeutung in der Nahrungssuche, Textilindustrie, Papierindustrie und für Bioethanol, Biokraftstoffe und Bioprodukte^15,16. Verschiedene chemische Methoden (z. B. Acetylbromid, saure Reinigungsmittel, Klason und Permanganatoxidation) sowie instrumentelle Methoden (z. B. Nahinfrarotspektroskopie (NIR), Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und Ultraviolettspektrophotometrie (UV) wurden zur Ligninquantifizierung^{verwendet 9,17}. Die Analysemethoden von Lignin werden im Allgemeinen nach elektromagnetischer Strahlung, Gravimetrie und Löslichkeit klassifiziert. Das Prinzip der Ligninabschätzung durch elektromagnetische Strahlung basierte auf der chemischen Eigenschaft von Lignin, mit der es Licht bei bestimmten Wellenlängen absorbiert. Diese Ergebnisse wurden auf der Grundlage des Prinzips geschätzt, dass Lignin eine stärkere UV-Absorption als Kohlenhydrate hat. Im Jahr 1962 verwendeten Bolker und Somerville Kaliumchloridpellets, um den Ligningehalt in Holz zu schätzen¹⁸. Diese Methode hat jedoch Nachteile bei der Abschätzung des Ligningehalts aus krautigen Proben aufgrund des Vorhandenseins von Nicht-Ligninphenolverbindungen und des Fehlens eines geeigneten Extinktionskoeffizienten. Im Jahr 1970 fanden Fergus und Goring heraus, dass die Absorptionsmaxima von Guaiacyl und Syringylverbindung bei 280 nm und 270 nm lagen, was das Problem des Extinktionskoeffizienten der Bolker- und Somerville-Methode^{korrigierte 19}. Später wurde die Infrarotspektroskopie, eine hochempfindliche Technik zur Charakterisierung von Phenolen, auch zur Ligninschätzung mit einer kleinen Menge pflanzlicher Biomasseproben eingesetzt. Ein Beispiel für eine solche Technologie war die diffreflektierte Fourier-Transformationsspektrophotometrie. Diesem Verfahren fehlt jedoch ein geeigneter Standard ähnlich dem UV-Verfahren^20. Später wurde der Ligningehalt mittels NIRS (Nahinfrarotspektroskopie) und NMR (Kernspinresonanzspektroskopie) geschätzt. Obwohl es Nachteile in diesen Methoden gibt, verändern sie nicht die chemische Struktur von Lignin und behalten seine Reinheit²⁰.

Die gravimetrische Klason-Methode ist eine direkte und zuverlässigste Analysemethode zur Ligninschätzung von holzigen Stängeln. Grundlage für die gravimetrische Ligninschätzung ist die Hydrolyse/Solubilisierung von Nicht-Ligninverbindungen und die Sammlung von unlöslichem Lignin für die Gravimetrie²¹. Bei diesem Verfahren werden die Kohlenhydrate durch Hydrolyse der Biomasse mit konzentriertem_H2SO4 entfernt, um Ligninreste^20,22zu extrahieren. Der mit dieser Methode geschätzte Ligningehalt wird als säureunlösliches Lignin oder Klason-Lignin bezeichnet. Die Anwendung der Klason-Methode hängt von der Pflanzenart, dem Gewebetyp und dem Zellwandtyp ab. Das Vorhandensein variabler Mengen an Nicht-Lignin-Komponenten wie Tanninen, Polysacchariden und Proteinen führt zu proportionalen Unterschieden bei der Abschätzung des gehalts an säureunlöslichem/löslichem Lignin. Daher wird die Klason-Methode nur für die Ligninschätzung von Biomasse mit hohem Ligningehalt wie holzigen Stängeln^{empfohlen 17,23}. Löslichkeitsmethoden wie Acetylbromid (AcBr), säureunlösliches Lignin und Thioglykolsäure (TGA) sind am häufigsten verwendete Methoden zur Abschätzung des Ligningehalts aus verschiedenen pflanzlichen Biomassequellen. Kim et al. etablierten zwei Methoden zur Ligninextraktion durch Solubilisierung. Das erste Verfahren extrahiert Lignin als unlöslichen Rückstand durch Solubilisieren von Cellulose und Hemicellulose, während das zweite Verfahren Lignin in der löslichen Fraktion trennt, wobei Cellulose und Hemicellulose als unlöslicher Rückstand^{24 verbleiben.}

Ähnliche Methoden, die bei der Ligninschätzung auf der Grundlage der Löslichkeit verwendet werden, sind Thioglykolsäure (TGA) und Acetylbromid (AcBr) Methoden²⁵. Sowohl TGA- als auch Acetylbromidmethoden schätzen den Ligningehalt, indem sie die Absorption des solubilisierten Lignins bei 280 nm messen; Die AcBr-Methode baut jedoch Xyle während des Prozesses der Lignin-Solubilisierung ab und zeigt einen falschen Anstieg des Ligningehalts²⁶. Die Thioglykolat-Methode (TGA) ist die zuverlässigere Methode, da sie von einer spezifischen Bindung mit den Thioethergruppen der Benzylalkoholgruppen von Lignin mit TGA abhängt. Das TGA-gebundene Lignin wird unter sauren Bedingungen unter Verwendung von HCl gefällt, und der Ligningehalt wird anhand seiner Absorption auf 280 nm²⁷geschätzt. Die TGA-Methode hat zusätzliche Vorteile von weniger strukturellen Modifikationen, einer löslichen Form der Ligninschätzung, weniger Interferenzen durch Nicht-Lignin-Komponenten und einer präzisen Schätzung von Lignin aufgrund spezifischer Bindung mit TGA.

Diese TGA-Methode wird basierend auf der Art der pflanzlichen Biomasseprobe modifiziert, die für die Schätzung des Ligningehalts verwendet wird. Hier haben wir die schnelle TGA-Methode von Reisstrohhalmen²⁷ auf Baumwollgewebe modifiziert und angepasst, um den Ligningehalt abzuschätzen. Kurz gesagt, die getrockneten pulverförmigen Pflanzenproben wurden einem Proteinlösibilisierungspuffer und einer Methanolextraktion unterzogen, um Proteine und die alkohollösliche Fraktion zu entfernen. Der alkoholunlösliche Rückstand wurde mit TGA und gefälltem Lignin unter sauren Bedingungen behandelt. Eine Lignin-Standardkurve wurde mit kommerziellem Bambus-Lignin erzeugt und eine Regressionslinie (y = mx+c) erhalten. Der “x”-Wert verwendet durchschnittliche Absorptionswerte von Lignin bei 280 nm, während “m”- und “c”-Werte aus der Regressionslinie eingegeben wurden, um unbekannte Ligninkonzentrationen in Baumwollpflanzen-Biomasseproben zu berechnen. Diese Methode ist in fünf Phasen unterteilt: 1) Vorbereitung von Pflanzenproben; 2) Waschen der Proben mit Wasser und Methanol; 3) Behandlung des Pellets mit TGA und Säure zum Ausfällung von Lignin; 4) Ausfällung von Lignin; und 5) die Standardkurvenvorbereitung und die Schätzung des Ligningehalts der Probe. Die ersten beiden Phasen konzentrieren sich in erster Linie auf die Pflanzenmaterialaufbereitung, gefolgt von Wasser-, PSB- (Protein-Solubilization Buffer) und Methanolextraktionen, um das alkoholunlösliche Material zu erhalten. Dann wurde es mit TGA (Thioglykolsäure) und HCl behandelt, um in der dritten Phase einen Komplex mit Lignin zu bilden. Am Ende wurde HCl verwendet, um Lignin auszuscheiden, das in Natriumhydroxid gelöst wurde, um seine Absorption bei 280 nm²⁸zu messen.