Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama
Summary
Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.
Abstract
Oosit nükleer olgunlaşması ile ilgili olaylar iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, döllenmeye ve totipotency kazanımı için sitoplazmada gerçekleşen moleküler yollar ve süreçler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşması sırasında, gen ifadesindeki değişiklikler transkripsiyon yerine sadece anne haberci RNA’ların (mRNA’lar) çevirisine ve bozulmasına bağlıdır. Bu nedenle, çeviri programının yürütülmesi, embriyo gelişimini sürdürmek için oosit gelişimsel yeterliliğinin oluşturulmasında kilit bir rol oynar. Bu makale, meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde gerçekleşen maternal mRNA çeviri programını tanımlamaya odaklanılmasının bir parçasıdır. Bu yöntem makalesinde, in vitro oosit olgunlaşması sırasında hedef mRNA’ların çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir strateji sunulmuştur. Burada, bir Ypet muhabiri, ilgi geninin 3′ çevrilmemiş bölgesine (UTR) kaynaştırıldı ve daha sonra enjekte edilen hacmi kontrol etmek için mCherry için poliadenillenmiş mRNA kodlaması ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. Muhabir birikimini ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak, oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde çeviri oranları hesaplanır. Burada, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR muhabiri örnek olarak kullanılarak, oosit izolasyonu ve enjeksiyonu, hızlandırılmış kayıt ve veri analizi protokolleri açıklanmıştır.
Introduction
Tamamen büyümüş bir memeli oosit, döllenmeye ve totipotency kazanımı için hazırlıkta hızlı değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler döllenme sonrası embriyonik gelişimi sürdürmek için gereklidir. Nükleer olgunlaşma ile ilişkili olaylar nispeten iyi tanımlanmış olsa da, oosit sitoplazmasındaki moleküler süreçler ve yollar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşmasının son aşamalarında, oositler transkripsiyonel olarak sessizdir ve gen ekspresyonu tamamen mRNA çevirisi ve bozulmasına bağlıdır1,2. Bu nedenle, gelişimsel yeterlilik için kritik proteinlerin sentezi, oosit büyümesi sırasında daha önce sentezlenen uzun ömürlü mRNA’ların zamanlanmış çevirisi programına dayanır1,3. Meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde yürütülen bu maternal mRNA çevirisi programını tanımlamaya odaklanan bu makale, in vitro meiotik olgunlaşma sırasında hedef maternal mRNA’ların tek oositlerde çevirisinin aktivasyonunu ve baskısını incelemek için bir strateji sunun bir parçası olarak sunulmaktadır.
Bu yöntemde, YPet açık okuma çerçevesi, ilgi dökümünün 3′ UTR’sının yukarı akışında klonlanır. Daha sonra, bu muhabiri kodlayan mRNA’lar, enjekte edilen hacmi kontrol etmek için poliadenillenmiş mRNA’lar kodlama mCherry ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. İn vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak muhabir birikimi ölçülür. Sarı floresan protein (YFP) ve mCherry birikimi bireysel oositlerde kaydedilir ve YFP sinyalleri birlikte enjekte edilen mCherry’nin platolu seviyesi ile düzeltilir. Veri toplama işleminden sonra eğrinin montajla elde edilen eğrinin eğimi hesaplanarak in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı zaman aralıkları için çeviri oranları hesaplanır.
Bu yaklaşım, seçilen endojen mRNA’ların çevirislerindeki değişiklikleri deneysel olarak onaylamak için bir araç sağlar. Ek olarak, bu yöntem, hedef mRNAs4,5,6’nın3′ UTR’sının cis düzenleyici unsurlarını manipüle ederek oosit meiotik olgunlaşma sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurların karakterizasyonunu kolaylaştırır. Poli(A) kuyruk uzunluğunun manipülasyonu ayrıca oositlerde adensilaz / deadenylaz aktivitesi hakkında fikir verir5. Cis etkili elementlerin mutajenisi veya RNA immün önksezisi, konyak RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri incelemek için kullanılabilir6,7. Ek olarak, bu yöntem, azaltılmış oosit kalitesi 8,9,10ile ilişkili modellerde hedef 3′ UTR çevirisini ölçerek oosit gelişimsel yeterliliği için kritik olan çeviri programının temel bileşenlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem makalesi, 21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded oositlerinin IL-7’nin 3′ UTR’sine kaynaşmış bir Ypet muhabiri ile mikro enjekte edildiği temsili bir deney sunun. Oosit enjeksiyonu, zaman atlamalı kayıt ve veri analizi için kurulum ve protokol açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde hedef mRNA’nın aktivasyonunu ve çevirisinin baskısını incelemek için bir stratejiyi açıklar. Oosit-kümülüs hücre iletişimi8,13,bu yöntemi tanımlamak amacıyla oosit tarafından salınan bir sitokin olan IL-7 seçildi. IL-7’nin oosit olgunlaşması8 sırasında giderek daha fazla çevrildiğini ve bu yöntemi kullanarak çevirisel ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R01 GM097165, GM116926 ve Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 tarafından Marco Conti’ye desteklenmiştir. Enrico M. Daldello, Lalor Vakfı’ndan bir burs, Natasja G. J. Costermans ise Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nden (NWO) rubicon bursu ile desteklendi.
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
