Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Un ovocito mamífero completamente crecido sufre cambios rápidos en la preparación para la fertilización y la adquisición de totipotency. Estos cambios son esenciales para sostener el desarrollo embrionario después de la fertilización. Aunque los eventos asociados con la maduración nuclear están relativamente bien descritos, se sabe mucho menos sobre los procesos moleculares y las vías en el citoplasma de los ovocitos. Durante las etapas finales de la maduración de los ovocitos, los ovocitos son transcripcionalmente silenciosos, y la expresión génica depende totalmente de la traducción y degradación del^{ARNm 1,2.} La síntesis de proteínas críticas para la competencia en el desarrollo, por lo tanto, se basa en un programa de traducción cronometiva de ARNm de larga vida que se han sintetizado antes durante el crecimiento^{de los ovocitos 1,3.} Como parte de un foco en la definición de este programa de la traducción maternal del mRNA ejecutada durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto, este papel presenta una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción de los mRNAs maternales de la blanco en solos ovocitos durante la maduración meiotic in vitro.

En este método, el marco de lectura abierto YPet se clona aguas arriba de la 3′ UTR de la transcripción de interés. A continuación, los ARNm que codifican este reportero se microinyectan en los ovocitos junto con los ARNm poliadenilados que codifican mCherry para controlar el volumen inyectado. La acumulación del reportero se mide durante la maduración meiótica in vitro del oocyte usando microscopia del lapso de tiempo. La acumulación de proteína fluorescente amarilla (YFP) y mCherry se registra en ovocitos individuales, y las señales de YFP se corrigen por el nivel estancado de la mCherry co-inyectada. Después de la adquisición de datos, las tasas de traducción se calculan para diferentes intervalos de tiempo durante la maduración meiótica de ovocitos in vitro calculando la pendiente de la curva obtenida por el ajuste de la curva.

Este enfoque proporciona una herramienta para confirmar experimentalmente los cambios en la traducción de ARNm endógenos seleccionados. Además, este método facilita la caracterización de los elementos reguladores que controlan la traslación durante la maduración meiótica de los ovocitos mediante la manipulación de elementos cis-reguladores de la UTR 3′ de los ARNm diana^4,5,6. La manipulación de la longitud de la cola de poli(A) también permite comprender la actividad de la adenilasa/deadenilasa en^{los ovocitos 5.} La mutagénesis de elementos de acción cis o inmunoprecipitación de ARN puede utilizarse para estudiar las interacciones con proteínas de unión a ARN cognado^6,7. Además, este método se puede utilizar para identificar los componentes esenciales del programa de traducción que son críticos para la competencia en el desarrollo de los ovocitos mediante la medición de la traducción de utr objetivo 3′ en modelos asociados con la disminución de la calidad ^{de los ovocitos 8,9,10.} Este papel del método presenta un experimento representativo donde los ovocitos denudados de 21 días de ratones C57/BL6 se han micro-inyectado con un reportero de Ypet fundido al 3′ UTR de IL-7. La configuración y el protocolo para la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito.