Определение программы трансляции материнской мРНК при созревании in vitro с помощью анализа одного репортера ооцитов
Summary
Этот протокол описывает репортерный анализ для изучения регуляции трансляции мРНК в отдельных ооцитах во время созревания in vitro.
Abstract
События, связанные с созреванием ядер ооцитов, хорошо описаны. Однако гораздо меньше известно о молекулярных путях и процессах, которые происходят в цитоплазме при подготовке к оплодотворению и приобретению тотипотентности. Во время созревания ооцитов изменения в экспрессии генов зависят исключительно от трансляции и деградации материнских матричных РНК (мРНК), а не от транскрипции. Таким образом, выполнение трансляционной программы играет ключевую роль в установлении компетентности развития ооцитов для поддержания развития эмбриона. Данная работа является частью фокуса на определении программы трансляции материнской мРНК, которая происходит во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу. В данной методе представлена стратегия исследования регуляции трансляции целевых мРНК при созревании ооцитов in vitro. Здесь репортер Ypet сливается с 3′-й нетранслируемой областью (UTR) интересуемого гена, а затем микроинъецируется в ооциты вместе с полиаденилированной мРНК, кодирующей для mCherry для контроля введенного объема. Используя покадровую микроскопию для измерения репортерного накопления, скорость трансляции рассчитывается при различных переходах во время мейотического созревания ооцитов. Здесь описаны протоколы выделения и инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных с использованием репортера Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR в качестве примера.
Introduction
Полностью выращенный ооцит млекопитающего претерпевает быстрые изменения при подготовке к оплодотворению и приобретении котипотентности. Эти изменения необходимы для поддержания эмбрионального развития после оплодотворения. Хотя события, связанные с ядерным созреванием, относительно хорошо описаны, гораздо меньше известно о молекулярных процессах и путях в цитоплазме ооцитов. На заключительных стадиях созревания ооцитов ооциты транскрипционно молчат, а экспрессия генов полностью зависит от трансляции и деградации мРНК1,2. Синтез белков, критически важных для развития компетентности, поэтому опирается на программу временной трансляции долгоживущих мРНК, которые были синтезированы ранее во время роста ооцитов1,3. В рамках акцента на определении этой программы трансляции материнской мРНК, выполняемой во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу, в статье представлена стратегия изучения активации и подавления трансляции целевых материнских мРНК в одиночных ооцитах при мейотическом созревании in vitro.
В этом методе открытая рамка чтения YPet клонируется выше 3′ UTR интересуемой транскрипты. Затем мРНК, кодирующие этот репортер, микроинъецируются в ооциты вместе с полиаденилированными мРНК, кодируемыми mCherry, для контроля инъецируемого объема. Накопление репортера измеряется во время мейотического созревания ооцитов in vitro с помощью покадровой микроскопии. Накопление желтого флуоресцентного белка (YFP) и mCherry регистрируется в отдельных ооцитах, а сигналы YFP корректируются плато-уровнем совместно вводимого mCherry. После сбора данных рассчитываются скорости трансляции для различных временных интервалов во время мейотического созревания мейотических яйцеклеток in vitro путем вычисления наклона кривой, полученной путем подгонки кривой.
Этот подход предоставляет инструмент для экспериментального подтверждения изменений в трансляции выбранных эндогенных мРНК. Кроме того, этот метод облегчает характеристику регуляторных элементов, контролирующих трансляцию во время мейотического созревания ооцитов путем манипулирования цис-регуляторными элементами 3′ UTR целевых мРНК4,5,6. Манипуляции с длиной поли(А) хвоста также позволяют понять активность аденилазы/моденилазы в ооцитах5. Мутагенез цис-действующих элементов или иммунопреципитация РНК может быть использован для изучения взаимодействий с родственными РНК-связывающими белками6,7. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации основных компонентов программы трансляции, которые имеют решающее значение для компетентности развития ооцитов, путем измерения целевой трансляции 3′ UTR в моделях, связанных со снижением качества ооцитов 8,9,10. В этой методной работе представлен репрезентативный эксперимент, в котором оголенные ооциты 21-дневных мышей C57 / BL6 были микроинъецированы с репортером Ypet, слитым с 3’UTR IL-7. Описаны установка и протокол для инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный метод описывает стратегию изучения активации и подавления трансляции целевой мРНК при различных переходах при мейотическом созревании мейотического созревания ооцитов in vitro. IL-7, цитокин, высвобождаемый ооцитом, который может быть вовлечен в ооцитар-кучевую клето?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R01 GM097165, GM116926 и Юнис Кеннеди Шрайвер NICHD Национальными центрами трансляционных исследований в области репродукции и бесплодия P50 HD055764 Марко Конти. Энрико М. Далделло был поддержан стипендией Фонда Лалора, а Натасья Г. Я. Костерманс была поддержана стипендией Рубикона от Нидерландской организации научных исследований (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
