Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único
Summary
Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.
Abstract
Eventos associados à maturação nuclear oócito foram bem descritos. No entanto, muito menos se sabe sobre as vias moleculares e processos que ocorrem no citoplasma em preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Durante a maturação do oócito, as mudanças na expressão genética dependem exclusivamente da tradução e degradação das RNAs (mRNAs) do mensageiro materno, em vez da transcrição. A execução do programa translacional, portanto, desempenha um papel fundamental no estabelecimento da competência de desenvolvimento oócito para sustentar o desenvolvimento de embriões. Este artigo faz parte de um foco na definição do programa de tradução materna de mRNA que ocorre durante a maturação meiotica e na transição oócito-zigoto. Neste artigo de método, é apresentada uma estratégia para estudar a regulação da tradução de mRNAs-alvo durante a maturação in vitro oócito. Aqui, um repórter Ypet é fundido à região não traduzida (UTR) de 3′ do gene de interesse e, em seguida, micro-injetado em oócitos juntamente com codificação mRNA poliadenilada para mCherry para controlar o volume injetado. Usando microscopia de lapso de tempo para medir o acúmulo de repórteres, as taxas de tradução são calculadas em diferentes transições durante o maturação meiotic oócito. Aqui, os protocolos de isolamento e injeção de oócitos, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos, usando o repórter Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR como exemplo.
Introduction
Um oócito mamífero totalmente cultivado sofre mudanças rápidas na preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Essas mudanças são essenciais para sustentar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. Embora os eventos associados à maturação nuclear sejam relativamente bem descritos, muito menos se sabe sobre os processos moleculares e caminhos no citoplasma oócito. Durante os estágios finais da maturação do oócito, os oócitos são transcricionalmente silenciosos, e a expressão genética é inteiramente dependente da tradução e degradação do mRNA1,2. A síntese de proteínas críticas para a competência do desenvolvimento, portanto, conta com um programa de tradução cronometrada de mRNAs de longa duração que foram sintetizadas anteriormente durante o crescimento do oócito1,3. Como parte de um foco na definição deste programa de tradução materna mRNA executado durante a maturação meiotic e na transição oólito-zigoto, este artigo apresenta uma estratégia para estudar a ativação e repressão da tradução de mRNAs maternas-alvo em oócitos únicos durante a maturação in vitro.
Neste método, o quadro de leitura aberto YPet é clonado a montante da UTR de 3′ da transcrição de interesse. Em seguida, mRNAs codificando este repórter são micro-injetados em oócitos juntamente com mRNAs poliadenilated codificando mCherry para controlar o volume injetado. O acúmulo de repórteres é medido durante a maturação meiotic in vitro oocíte usando microscopia de lapso de tempo. O acúmulo de proteína fluorescente amarela (YFP) e mCherry é registrado em oócitos individuais, e os sinais de YFP são corrigidos pelo nível nivelado do mCherry co-injetado. Após a aquisição dos dados, as taxas de tradução são calculadas para diferentes intervalos de tempo durante a maturação meiotic in vitro oocito calculando a inclinação da curva obtida pelo encaixe da curva.
Esta abordagem fornece uma ferramenta para confirmar experimentalmente mudanças na tradução de mRNAs endógenos selecionados. Além disso, este método facilita a caracterização de elementos regulatórios que controlam a tradução durante o amadurecimento meiotico oocíte, manipulando elementos cis-regulatórios da UTR de 3′ dasmRNAs-alvo 4,5,6. A manipulação do comprimento da cauda poli(A) também permite a percepção da atividade adenylase/deadenylase em oócitos5. Mutagênese de elementos cis-ação ou imunoprecipitação de RNA pode ser usado para estudar interações com proteínas de ligação RNA cogina6,7. Além disso, este método pode ser usado para identificar componentes essenciais do programa de tradução que são críticos para a competência de desenvolvimento oócito, medindo a tradução UTR alvo 3′ em modelos associados à diminuição da qualidade do oócito 8,9,10. Este artigo de método apresenta um experimento representativo onde oócitos desnudados de camundongos C57/BL6 de 21 dias de idade foram micro-injetados com um repórter Ypet fundido ao UTR de 3′ de IL-7. A configuração e o protocolo para injeção de oócito, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado descreve uma estratégia para estudar a ativação e a repressão da tradução do mRNA alvo em diferentes transições durante a maturação meiotic in vitro oocito. IL-7, uma citocina liberada pelo oócito que pode estar envolvida na comunicação celular oócito-cumulus8,13, foi escolhida com o propósito de descrever este método. O IL-7 é conhecido por ser cada vez mais traduzido durante a maturação do oócito<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM097165, GM116926 e Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 para Marco Conti. Enrico M. Daldello foi apoiado por uma bolsa da Fundação Lalor e Natasja G. J. Costermans foi apoiada por uma bolsa Rubicon da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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