הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.
Abstract
אירועים הקשורים התבגרות גרעינית ביצית תוארו היטב. עם זאת, הרבה פחות ידוע על המסלולים המולקולריים והתהליכים המתרחשים בציטופלסמה כהכנה להפריה ורכישה של totipotency. במהלך התבגרות ביצית, שינויים בביטוי גנים תלויים אך ורק בתרגום והשפלה של RNAs שליח אימהי (mRNAs) ולא על שעתוק. ביצוע תוכנית התרגום, אם כן, ממלא תפקיד מפתח בביסוס יכולת התפתחותית ביצית לקיים התפתחות עובר. מאמר זה הוא חלק מהתמקדות בהגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי המתרחשת במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה. במאמר שיטה זו, מוצגת אסטרטגיה ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNAs היעד במהלך התבגרות ביצית במבחנה. כאן, כתב Ypet הוא התמזגו לאזור 3′ לא מתורגם (UTR) של הגן של עניין ולאחר מכן מיקרו מוזרק לתוך ביציות יחד עם קידוד mRNA polyadenylated עבור mCherry לשלוט עבור נפח מוזרק. על ידי שימוש במיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי למדוד הצטברות כתב, שיעורי התרגום מחושבים במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית. כאן תוארו הפרוטוקולים לבידוד והזרקה של ביציות, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים, באמצעות כתב UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ כדוגמה.
Introduction
ביצית יונקים בוגרת עוברת שינויים מהירים כהכנה להפריה ורכישה של טוטיפופוטנציה. שינויים אלה חיוניים כדי לקיים התפתחות עוברית לאחר ההפריה. למרות האירועים הקשורים התבגרות גרעינית מתוארים היטב יחסית, הרבה פחות ידוע על התהליכים המולקולריים ואת המסלולים בציטופלסמה ביצית. במהלך השלבים הסופיים של התבגרות ביצית, ביציות שקטות שעתוק, וביטוי גנים תלוי לחלוטין בתרגום mRNA והשפלה1,2. הסינתזה של חלבונים קריטיים ליכולת התפתחותית, אם כן, מסתמכת על תוכנית של תרגום מתוזמן של mRNAs ארוכי טווח שעברו סינתזה מוקדם יותר במהלך צמיחת ביצית1,3. כחלק מהתמקדות בהגדרת תוכנית זו של תרגום mRNA אימהי שבוצע במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה, מאמר זה מציג אסטרטגיה ללמוד את ההפעלה והדיכוי של התרגום של mRNAs אימהי היעד ביציות בודדות במהלך אימהות מיוטית במבחנה.
בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של YPet משובטת במעלה הזרם של UTR 3 ‘ של תמליל העניין. לאחר מכן, mRNAs קידוד כתב זה מוזרק מיקרו לתוך ביציות יחד עם mRNAs polyadenylated קידוד mCherry כדי לשלוט על נפח מוזרק. הצטברות הכתב נמדדת במהלך התבגרות מיוטית במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה של זמן לשגות. הצטברות של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- mCherry נרשמת ביציות בודדות, ואותות YFP מתוקנים על ידי הרמה של mCherry מוזרק במשותף. לאחר רכישת נתונים, שיעורי תרגום מחושבים עבור מרווחי זמן שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית במבחנה על ידי חישוב השיפוע של העקומה המתקבל על ידי התאמת עקומה.
גישה זו מספקת כלי לאישור ניסיוני של שינויים בתרגום של mRNAs אנדוגני נבחרים. בנוסף, שיטה זו מקלה על אפיון של אלמנטים רגולטוריים השולטים בתרגום במהלך התבגרות מיוטית ביצית על ידי מניפולציה של אלמנטים cis-תקינה של 3 ‘ UTR של mRNAs היעד4,5,6. מניפולציה של אורך הזנב פולי(A) גם מאפשר תובנה לתוך פעילות אדניאלאז / deadenylase ביציות5. Mutagenesis של אלמנטים cis-acting או immunoprecipitation RNA יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות עם חלבונים מחייבים RNA קוגנט6,7. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות רכיבים חיוניים של תוכנית התרגום כי הם קריטיים עבור יכולת התפתחותית ביצית על ידי מדידת יעד 3 ‘ תרגום UTR במודלים הקשורים לירידה באיכות ביצית 8,9,10. נייר שיטה זה מציג ניסוי מייצג שבו ביציות של עכברי C57/BL6 בני 21 יום הוזרקו במיקרו עם כתב Ypet מותך UTR 3 ‘ של IL-7. ההתקנה והפרוטוקול להזרקת ביצית, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים תוארו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת מתארת אסטרטגיה ללמוד הפעלה והדחקה של תרגום mRNA היעד במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית במבחנה ביצית. IL-7, ציטוקינים שפורסמו על ידי ביצית שעשויים להיות מעורבים בתקשורת תא ביצית8,13, נבחר לצורך תיאור שיטה זו. IL-7 ידוע להיות מתורגם יותר ויותר במה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM097165, GM116926 ו יוניס קנדי שרייבר NICHD המרכזים הלאומיים למחקר תרגום רבייה ועקרות P50 HD055764 למרקו קונטי. אנריקו מ. דלדלו נתמך על ידי מלגת קרן לור ונטסיה ג’יי קוסטרמן נתמכה על ידי מלגת רוביקון מארגון המחקר המדעי של הולנד (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
