Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor
Summary
Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.
Abstract
O principal obstáculo no desenvolvimento de técnicas de triagem de medicamentos para avaliar a eficácia de estratégias terapêuticas em doenças complexas é encontrar um equilíbrio entre a simplificação in vitro e a recriação do complexo ambiente in vivo, juntamente com o objetivo principal, compartilhado por todas as estratégias de triagem, de obtenção de dados robustos e confiáveis, altamente preditivos para a tradução in vivo.
No campo das doenças desmielinizantes, a maioria das estratégias de rastreamento de medicamentos baseia-se em linhas celulares imortalizadas ou culturas puras de células precursoras de oligodendrocytos primários isolados (OPCs) de animais recém-nascidos, levando a fortes vieses devido à falta de diferenças relacionadas à idade e a qualquer condição ou complexidade patológica real.
Aqui mostramos a configuração de um sistema in vitro destinado a modelar a diferenciação fisiológica/maturação de OPCs derivados de células-tronco neurais (NSC), facilmente manipulados para imitar condições patológicas típicas de doenças desmielinizantes. Além disso, o método inclui o isolamento de cérebros fetais e adultos, dando um sistema que se diferencia dinamicamente de OPCs para oligodenrócitos maduros (OLs) em uma cocultura espontânea que também inclui astrócitos. Este modelo se assemelha fisiologicamente ao processo de mielinação mediada por hormônios da tireoide e processo de reparação da mielina, permitindo a adição de interferentes patológicos que modelam mecanismos da doença. Mostramos como imitar os dois principais componentes das doenças desmielinizantes (ou seja, hipoxia/isquemia e inflamação), recriando seu efeito na mielina do desenvolvimento e na reparação da mielina adulta e levando em conta todos os componentes celulares do sistema, ao mesmo tempo em que focamos na diferenciação de OPCs.
Este modelo misto espontâneo, juntamente com tecnologias de triagem de alto conteúdo baseadas em células, permite o desenvolvimento de um sistema robusto e confiável de triagem de medicamentos para estratégias terapêuticas destinadas a combater os processos patológicos envolvidos na desmielinização e induzir a remielinização.
Introduction
No sistema nervoso central (SNC), as células formadoras de mielina (oligodendrocytes, OLs) e seus precursores (células precursoras oligodendrocytes, OPCs) são responsáveis pela mielinação do desenvolvimento, processo que ocorre durante os períodos peri e pós-natal, e para a rotatividade e reparação da mielina (remielinização) na idade adulta1. Essas células são altamente especializadas, interagindo anatomicamente e funcionalmente com todos os outros componentes gliais e neuronais, tornando-as uma parte fundamental da estrutura e função do CNS.
Eventos desmelique estão envolvidos em diferentes lesões e doenças do CNS2, e atuam principalmente em OPCs e OLs por meio de mecanismos multifatoriais, tanto durante o desenvolvimento quanto na idade adulta. Os precursores indiferenciados são impulsionados por fatores diferenciadores, principalmente o hormônio da tireoide (TH), em um processo sincronizado3 que leva o OPC a reconhecer e responder a estímulos específicos que induzem a proliferação, migração para o axônio não mielinado e diferenciação em OLs maduros que, por sua vez, desenvolvem a baiamielina 4. Todos esses processos são finamente controlados e ocorrem em um ambiente complexo.
Devido à natureza complexa dos eventos de mielinação, remielinação e dessalinização, há uma grande necessidade de um método in vitro simplificado e confiável para estudar os mecanismos subjacentes e desenvolver novas estratégias terapêuticas, com foco no principal player celular: o OPC5.
Para que um sistema in vitro seja confiável, uma série de fatores precisam ser levados em conta: a complexidade do ambiente celular, diferenças intrínsecas relacionadas à idade celular, diferenciação fisiológica mediada pelo TH, mecanismos patológicos e a robustez dos dados6. De fato, a necessidade não atendida no campo é um modelo que imita a complexidade da condição in vivo, não alcançada com sucesso através do uso de culturas OPC puras isoladas. Além disso, os dois principais componentes dos eventos desmielinizadores, inflamação e hipóxia/isquemia (OI), envolvem diretamente outros componentes celulares que podem afetar indiretamente a diferenciação fisiológica e a maturação das OPCs, aspecto que não pode ser estudado em modelos in vitro super simplificados.
A partir de um sistema de cultura altamente preditivo, o desafio subsequente e mais geral é a produção de dados robustos e confiáveis. Nesse contexto, a triagem de alto teor baseado em células (HCS) é a técnica mais adequada7, uma vez que nosso objetivo é, em primeiro lugar, analisar toda a cultura em um fluxo de trabalho automático, evitando o viés de escolha de campos representativos e, em segundo lugar, obter a geração automática e simultânea de dados de alto conteúdo baseados em imagem8.
Dado que a principal necessidade é alcançar o melhor equilíbrio entre a simplificação in vitro e a complexidade in vivo-imitação, aqui apresentamos um método altamente reprodutível para a obtenção de OPCs derivados de células-tronco neurais (NSCs) isoladas do cérebro fetal e da zona sub-ventricular adulta (SVZ). Este modelo in vitro abrange todo o processo de diferenciação OPC, desde NSC multipotente até OL maduro/mieliing, de forma fisiológica dependente de TH. A cultura resultante é um sistema de diferenciação/amadurecimento dinamicamente que resulta em uma cocultura espontânea que consiste principalmente em diferenciar OPCs e astrócitos, com baixa porcentagem de neurônios. Essa cultura primária imita melhor o complexo ambiente in vivo, enquanto sua derivação de células-tronco permite que manipulações simples sejam realizadas para obter o enriquecimento de linhagem celular desejado.
Ao contrário de outras estratégias de triagem de medicamentos utilizando linhas celulares ou culturas puras de OPCs primárias, o método descrito aqui permite o estudo do efeito de interferentes patológicos ou moléculas terapêuticas em um ambiente complexo, sem perder o foco no tipo celular desejado. O fluxo de trabalho do HCS descrito permite uma análise da viabilidade celular e especificação de linhagem, bem como de morte celular específica da linhagem e parâmetros morfológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A natureza complexa dos processos de mielinação/remielinização e eventos desmielinização torna o desenvolvimento de sistemas in vitro preditivos extremamente desafiadores. Os sistemas de triagem de drogas in vitro mais utilizados são principalmente linhas de células humanas ou culturas primárias de OL puras, com uso crescente de co-culturas mais complexas ou sistemas organotipicos15. Mesmo que tais sistemas estejam associados a tecnologias de alto conteúdo, culturas puras de OL continuam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoiado pelo PROJETO DE CLUSTERS Nacionais de Tecnologia MIUR IRMI (CTN01_00177_888744) e Região Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Agradecimentos especiais à Fundação IRET por sediar o trabalho experimental.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
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