عالية المحتوى فحص التمايز وتحليل النضج من الجنين والكبار الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من ثقافات الخلايا السليفة Oligodendrocyte
Summary
نحن نصف إنتاج الثقافات المختلطة من الخلايا الفلكية وخلايا أوليغودندروسيت السلائف المستمدة من الخلايا الجذعية العصبية الجنينية أو البالغة التي تختلف إلى أوليغودندروسيت ناضجة ، والنمذجة في المختبر من المحفزات الضارة. الاقتران مع تقنية فحص عالية المحتوى تعتمد على الخلية يبني نظام فحص المخدرات موثوقة وقوية.
Abstract
العقبة الرئيسية في تطوير تقنيات فحص الأدوية لتقييم فعالية الاستراتيجيات العلاجية في الأمراض المعقدة هي تحقيق التوازن بين التبسيط في المختبر وإعادة إنشاء المجمع في بيئة الجسم الحي ، جنبا إلى جنب مع الهدف الرئيسي ، الذي تشترك فيه جميع استراتيجيات الفحص ، للحصول على بيانات قوية وموثوقة ، تنبؤية للغاية للترجمة في الجسم الحي.
في مجال الأمراض المزيلة للميالين ، تستند غالبية استراتيجيات فحص الأدوية إلى خطوط الخلايا الخالدة أو الثقافات النقية لخلايا أولية أولية معزولة من السلائف الأولية (OPCs) من الحيوانات الوليدة ، مما يؤدي إلى تحيزات قوية بسبب عدم وجود اختلافات مرتبطة بالعمر وأي حالة مرضية حقيقية أو تعقيد.
هنا نعرض إعداد نظام في المختبر يهدف إلى نمذجة التمايز الفسيولوجي / نضوج الخلايا الجذعية العصبية (NSC) المشتقة من OPCs ، التي يتم التلاعب بها بسهولة لمحاكاة الظروف المرضية النموذجية للأمراض المزيلة للمنافس. وعلاوة على ذلك، تتضمن الطريقة العزلة عن أدمغة الجنين والبالغين، وإعطاء النظام الذي يميز ديناميكيا من OPCs إلى oligodendrocytes ناضجة (OLs) في ثقافة مشتركة عفوية والتي تشمل أيضا الخلايا الفلكية. يشبه هذا النموذج من الناحية الفسيولوجية المايلين بوساطة هرمون الغدة الدرقية وعملية إصلاح المايلين ، مما يسمح بإضافة التدخلات المرضية التي نموذج آليات المرض. نعرض كيفية محاكاة المكونين الرئيسيين للأمراض إزالة الميالين (أي نقص الأكسيا / نقص التروية والالتهاب) ، وإعادة تأثيرها على المايلين التنموي وإصلاح المايلين البالغ وأخذ جميع مكونات الخلية في النظام في الاعتبار طوال الوقت ، مع التركيز على التمييز بين OPCs.
ويتيح هذا النموذج المختلط التلقائي، مقترنا بتكنولوجيات الفحص عالية المحتوى القائمة على الخلايا، تطوير نظام قوي وموثوق لفحص الأدوية من أجل استراتيجيات علاجية تهدف إلى مكافحة العمليات المرضية التي تنطوي عليها إزالة المايلين والحث على إعادة الايلين.
Introduction
في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تكون خلايا تشكيل المايلين (oligodendrocytes ، OLs) وسلائفها (خلايا أوليغودندروسيت السليفة ، OPCs) مسؤولة عن المايلين التنموي ، وهي عملية تحدث خلال فترات ما حول الولادة وما بعدها ، وبالنسبة لدوران المايلين وإصلاحه(إعادةالايلين) في مرحلة البلوغ 1 . هذه الخلايا هي متخصصة للغاية، والتفاعل تشريحيا ووظيفيا مع جميع المكونات الأخرى الدبقية والخلايا العصبية، مما يجعلها جزءا أساسيا من بنية الجهاز العصبي المركزي ووظيفة.
وتشارك الأحداث إزالة الميالين في إصابات وأمراض الجهاز العصبي المركزي المختلفة2، وتعمل أساسا على OPCs وOLs عن طريق آليات متعددة العوامل ، سواء أثناء النمو والبلوغ. السلائف غير المتمايزة مدفوعة بعوامل متمايزة ، أهمها هرمون الغدة الدرقية (TH) ، في عملية متزامنة3 مما يؤدي إلى التعرف على OPC والاستجابة لمحفزات محددة تحفز الانتشار ، والهجرة إلى المحور غير الميالين ، والتمايز إلى OLs ناضجة والتي بدورها تطور غمد المايلين4. يتم التحكم في كل هذه العمليات بدقة وتحدث في بيئة معقدة.
نظرا للطبيعة المعقدة لأحداث المايلين ، وإعادة الايلين ، وإزالة الميالين ، هناك حاجة كبيرة إلى طريقة مبسطة وموثوقة في المختبر لدراسة الآليات الأساسية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة ، مع التركيز على اللاعب الخلوي الرئيسي: OPC5.
لكي يكون النظام المختبري موثوقا به ، يجب أخذ عدد من العوامل في الاعتبار: تعقيد البيئة الخلوية ، والاختلافات الجوهرية المرتبطة بالعمر ، والتمايز الفسيولوجي بوساطة TH ، والآليات المرضية ، وقوة البيانات6. والواقع أن الحاجة غير الملباة في هذا المجال هي نموذج يحاكي تعقيد الحالة في الجسم الحي، ولا يتحقق بنجاح من خلال استخدام ثقافات OPC النقية المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المكونين الرئيسيين للأحداث إزالة الميالين ، الالتهاب ونقص الأكسيجة / نقص التروية (HI) ، ينطويان بشكل مباشر على مكونات الخلايا الأخرى التي قد تؤثر بشكل غير مباشر على التمايز الفسيولوجي ونضوج OPCs ، وهو جانب لا يمكن دراسته في نماذج المختبر المبسطة بشكل مفرط.
10 – انطلاقا من نظام ثقافي تنبؤي للغاية، يتمثل التحدي اللاحق والأكثر عمومية في إنتاج بيانات قوية وموثوقة. في هذا السياق ، فحص المحتوى العالي القائم على الخلية (HCS) هو الأسلوب الأنسب 7 ، حيث أنهدفناأولا هو تحليل الثقافة بأكملها في سير عمل تلقائي ، وتجنب التحيز في اختيار الحقول التمثيلية ، وثانيا الحصول على الجيل التلقائي والمتزامن من البيانات عالية المحتوى المستندة إلى التصوير8.
وبالنظر إلى أن الحاجة الرئيسية هي تحقيق أفضل توازن بين التبسيط في المختبر وفي تعقيد محاكاة الجسم الحي ، نقدم هنا طريقة قابلة للاستنساخ للغاية للحصول على OPCs المستمدة من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) المعزولة عن الجنين الأمامي ومنطقة البطين الفرعي للبالغين (SVZ). يشمل هذا النموذج في المختبر عملية التمايز OPC بأكملها ، من NSC متعدد القدرات إلى OL الناضج / الميالين ، بطريقة فسيولوجية تعتمد على TH. الثقافة الناتجة هي نظام التفريق الديناميكي / النضج الذي يؤدي إلى ثقافة مشتركة عفوية تتكون أساسا من التمييز بين OPCs والخلايا الفلكية ، مع نسبة منخفضة من الخلايا العصبية. هذه الثقافة الأولية تحاكي بشكل أفضل المجمع في بيئة الجسم الحي ، في حين أن اشتقاق الخلايا الجذعية يسمح بإجراء عمليات تلاعب بسيطة للحصول على إثراء نسب الخلية المطلوب.
على العكس من استراتيجيات فحص الأدوية الأخرى باستخدام خطوط الخلايا أو الثقافات النقية ل OPCs الأولية ، فإن الطريقة الموصوفة هنا تسمح بدراسة تأثير التداخلات المرضية أو الجزيئات العلاجية في بيئة معقدة ، دون فقدان التركيز على نوع الخلية المطلوب. يسمح سير عمل HCS بتحليل قابلية الخلية للحياة ومواصفات النسب ، وكذلك موت الخلايا الخاصة بالنسب والمعلمات المورفولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن الطبيعة المعقدة لعمليات المايلين/إعادة التهييض والأحداث التي تزيل الميالين تجعل تطوير النظم التنبؤية في المختبر أمرا صعبا للغاية. الأكثر استخداما في المختبر نظم فحص المخدرات هي في الغالب خطوط الخلايا البشرية أو الثقافات OL نقية الأولية, مع زيادة استخدام الثقافات المشتركة أكثر تعقيدا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من مجموعة التكنولوجيا الوطنية MIUR IRMI (CTN01_00177_888744)، والمنطقة إميليا رومانيا، Mat2Rep، POR-FESR 2014-2020.
شكر خاص لمؤسسة IRET لاستضافة العمل التجريبي.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
