Descriviamo la produzione di colture miste di astrociti e cellule precursori di oligodendrociti derivate da cellule staminali neurali fetali o adulte che si differenziano in oligodendrociti maturi e la modellazione in vitro di stimoli nocivi. L’accoppiamento con una tecnica di screening ad alto contenuto basata su cellule costruisce un sistema di screening dei farmaci affidabile e robusto.
L’ostacolo principale nello sviluppo di tecniche di screening farmacologico per valutare l’efficacia delle strategie terapeutiche nelle malattie complesse è trovare un equilibrio tra la semplificazione in vitro e la ricreazione del complesso ambiente in vivo, insieme all’obiettivo principale, condiviso da tutte le strategie di screening, di ottenere dati robusti e affidabili, altamente predittivi per la traduzione in vivo.
Nel campo delle malattie demielinizzanti, la maggior parte delle strategie di screening farmacologico si basa su linee cellulari immortalizzate o colture pure di cellule precursori primarie di oligodendrociti (OPC) isolate da animali appena nati, portando a forti pregiudizi dovuti alla mancanza di differenze legate all’età e di qualsiasi condizione patologica o complessità reale.
Qui mostriamo l’impostazione di un sistema in vitro volto a modellare la fisiologica differenziazione/maturazione delle OPC derivate da cellule staminali neurali (NSC), facilmente manipolabili per imitare le condizioni patologiche tipiche delle malattie demielinizzanti. Inoltre, il metodo include l’isolamento dal cervello fetale e adulto, dando un sistema che si differenzia dinamicamente dagli OPC agli oligodendrociti maturi (OL) in una co-coltura spontanea che include anche gli astrociti. Questo modello assomiglia fisiologicamente al processo di mielinizzazione mediata dall’ormone tiroideo e al processo di riparazione della mielina, consentendo l’aggiunta di interferenti patologici che modellano i meccanismi della malattia. Mostriamo come imitare i due componenti principali delle malattie demielinizzanti (cioè ipossia / ischemia e infiammazione), ricreando il loro effetto sulla mielinizzazione dello sviluppo e sulla riparazione della mielina adulta e prendendo in considerazione tutti i componenti cellulari del sistema in tutto, concentrandoci sulla differenziazione delle OPC.
Questo modello misto spontaneo, abbinato a tecnologie di screening ad alto contenuto cellulari, consente lo sviluppo di un sistema di screening farmacologico robusto e affidabile per strategie terapeutiche volte a combattere i processi patologici coinvolti nella demielinizzazione e nell’indurre la rimielinizzazione.
Nel sistema nervoso centrale (SNC), le cellule che formano la mielina (oligodendrociti, OL) e i loro precursori (cellule precursori degli oligodendrociti, OPC) sono responsabili della mielinizzazione dello sviluppo, un processo che si verifica durante i periodi peri- e post-natale, e del turnover e della riparazione della mielina (rimielinizzazione) in età adulta1. Queste cellule sono altamente specializzate, interagiscono anatomicamente e funzionalmente con tutte le altre componenti gliali e neuronali, rendendole una parte fondamentale della struttura e della funzione del SNC.
Gli eventi demielinizzanti sono coinvolti in diverse lesioni e malattie del SNC2e agiscono principalmente su OPC e OL attraverso meccanismi multifattoriali, sia durante lo sviluppo che in età adulta. I precursori indifferenziati sono guidati da fattori differenzianti, principalmente l’ormone tiroideo (TH), in un processo sincronizzato3 che porta l’OPC a riconoscere e rispondere a stimoli specifici che inducono proliferazione, migrazione verso l’assone non mielinizzato e differenziazione in OL mature che a loro volta sviluppano la guaina mielinica4. Tutti questi processi sono finemente controllati e si verificano in un ambiente complesso.
A causa della natura complessa degli eventi di mielinizzazione, rimielinizzazione e demielinizzazione, c’è un grande bisogno di un metodo in vitro semplificato e affidabile per studiare i meccanismi sottostanti e sviluppare nuove strategie terapeutiche, concentrandosi sul principale attore cellulare: l’OPC5.
Affinché un sistema in vitro sia affidabile, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori: la complessità dell’ambiente cellulare, le differenze intrinseche cellulari legate all’età, la differenziazione fisiologica mediata da TH, i meccanismi patologici e la robustezza dei dati6. In effetti, il bisogno insoddisfatto sul campo è un modello che imita la complessità della condizione in vivo, non raggiunta con successo attraverso l’uso di colture OPC pure isolate. Inoltre, le due componenti principali degli eventi demielinizzanti, infiammazione e ipossia/ischemia (HI), coinvolgono direttamente altre componenti cellulari che possono influenzare indirettamente la fisiologica differenziazione e maturazione delle OPC, aspetto che non può essere studiato in modelli in vitro eccessivamente semplificati.
Partendo da un sistema di cultura altamente predittivo, la sfida successiva e più generale è la produzione di dati robusti e affidabili. In questo contesto, lo screening ad alto contenuto cellulare (HCS) è la tecnica più adatta7, poiché il nostro obiettivo è in primo luogo analizzare l’intera cultura in un flusso di lavoro automatico, evitando il pregiudizio di scegliere campi rappresentativi e in secondo luogo ottenere la generazione automatica e simultanea di dati ad alto contenuto basati su imaging8.
Dato che la necessità principale è quella di raggiungere il miglior equilibrio tra semplificazione in vitro e complessità che imita in vivo, qui presentiamo un metodo altamente riproducibile per ottenere OPC derivate da cellule staminali neurali (NSC) isolate dal proencefalo fetale e dalla zona sub-ventricolare adulta (SVZ). Questo modello in vitro comprende l’intero processo di differenziazione OPC, dal NSC multipotente all’OL maturo/mielinizzante, in modo fisiologico TH-dipendente. La coltura risultante è un sistema dinamicamente differenziante/maturante che si traduce in una co-coltura spontanea costituita principalmente da OPC e astrociti differenzianti, con una bassa percentuale di neuroni. Questa coltura primaria imita meglio il complesso ambiente in vivo, mentre la sua derivazione di cellule staminali consente di eseguire semplici manipolazioni per ottenere l’arricchimento del lignaggio cellulare desiderato.
Al contrario di altre strategie di screening farmacologico che utilizzano linee cellulari o colture pure di OPC primarie, il metodo qui descritto consente lo studio dell’effetto di interferenti patologici o molecole terapeutiche in un ambiente complesso, senza perdere l’attenzione sul tipo di cellula desiderato. Il flusso di lavoro HCS descritto consente un’analisi della vitalità cellulare e delle specifiche di lignaggio, nonché della morte cellulare specifica del lignaggio e dei parametri morfologici.
La natura complessa dei processi di mielinizzazione/rimielinizzazione e degli eventi demielinizzanti rende estremamente impegnativo lo sviluppo di sistemi predittivi in vitro. I sistemi di screening farmacologico in vitro più utilizzati sono per lo più linee cellulari umane o colture PRIMARIE di OL puro, con un uso crescente di co-colture più complesse o sistemi organotipici15. Anche se tali sistemi sono accoppiati con tecnologie ad alto contenuto, le colture OL pure rimangono il metodo di scel…
The authors have nothing to disclose.
Sostenuto dal PROGETTO IRMI (CTN01_00177_888744) dei Cluster Tecnologici Nazionali del MIUR e dalla Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Un ringraziamento speciale a Fondazione IRET per aver ospitato il lavoro sperimentale.
96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
IFN-γ | Origene | TP721239 | |
IL-17A | Origene | TP723199 | |
IL-1β | Origene | TP723210 | |
IL-6 | Origene | TP723240 | |
laminin | GIBCO | 23017-051 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
PBS | GIBCO | 70011-036 | |
Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
TNF-α | Origene | TP723451 | |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |