High-Content Screening Differentiatie en Rijpingsanalyse van foetale en volwassen neurale stamcel-afgeleide oligodendrocyten precursor celculturen
Summary
We beschrijven de productie van gemengde culturen van astrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen afgeleid van foetale of volwassen neurale stamcellen die differentiëren in volwassen oligodendrocyten, en in vitro modellering van schadelijke stimuli. De koppeling met een celgebaseerde high-content screeningtechniek bouwt een betrouwbaar en robuust screeningsysteem voor geneesmiddelen op.
Abstract
De belangrijkste hindernis bij het ontwikkelen van screeningstechnieken voor geneesmiddelen voor het beoordelen van de werkzaamheid van therapeutische strategieën bij complexe ziekten is het vinden van een evenwicht tussen in vitro vereenvoudiging en het opnieuw creëren van de complexe in vivo omgeving, samen met het belangrijkste doel, gedeeld door alle screeningstrategieën, het verkrijgen van robuuste en betrouwbare gegevens, zeer voorspellend voor in vivo vertaling.
Op het gebied van demyeliniserende ziekten zijn de meeste screeningstrategieën voor geneesmiddelen gebaseerd op onsterfelijke cellijnen of zuivere culturen van geïsoleerde primaire oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC’s) van pasgeboren dieren, wat leidt tot sterke vooroordelen als gevolg van het ontbreken van leeftijdsgerelateerde verschillen en van een echte pathologische aandoening of complexiteit.
Hier tonen we de opstelling van een in vitro systeem gericht op het modelleren van de fysiologische differentiatie / rijping van neurale stamcel (NSC) -afgeleide OPC’s, gemakkelijk te manipuleren om pathologische aandoeningen na te bootsen die typerend zijn voor demyeliniserende ziekten. Bovendien omvat de methode isolatie van foetale en volwassen hersenen, waardoor een systeem ontstaat dat dynamisch differentieert van OPC’s naar volwassen oligodendrocyten (OK’s) in een spontane co-cultuur die ook astrocyten omvat. Dit model lijkt fysiologisch op het schildklierhormoon-gemedieerde myelinisatie- en myelineherstelproces, waardoor pathologische interferents kunnen worden toegevoegd die ziektemechanismen modelleren. We laten zien hoe we de twee belangrijkste componenten van demyeliniserende ziekten (d.w.z. hypoxie / ischemie en ontsteking) kunnen nabootsen, hun effect op ontwikkelingsmyelinisatie en volwassen myelineherstel kunnen recreëren en rekening houden met alle celcomponenten van het systeem, terwijl we ons concentreren op het differentiëren van OPC’s.
Dit spontane gemengde model, in combinatie met celgebaseerde screeningtechnologieën met een hoog gehalte, maakt de ontwikkeling mogelijk van een robuust en betrouwbaar screeningsysteem voor geneesmiddelen voor therapeutische strategieën gericht op het bestrijden van de pathologische processen die betrokken zijn bij demyelinisatie en het induceren van remyelinisatie.
Introduction
In het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn myelinevormende cellen (oligodendrocyten, OK’s) en hun voorlopers (oligodendrocytenvoorlopercellen, OPC’s) verantwoordelijk voor ontwikkelingsmyelinisatie, een proces dat optreedt tijdens de peri- en postnatale periodes, en voor myeline-omzet en -herstel (remyelinisatie) op volwassen leeftijd1. Deze cellen zijn zeer gespecialiseerd en interageren anatomisch en functioneel met alle andere gliale en neuronale componenten, waardoor ze een fundamenteel onderdeel zijn van de structuur en functie van het CZS.
Demyeliniserende gebeurtenissen zijn betrokken bij verschillende CZS-verwondingen en -ziekten2en werken voornamelijk in op opc’s en OK’s door middel van multifactoriële mechanismen, zowel tijdens de ontwikkeling als tijdens de volwassenheid. De ongedifferentieerde voorlopers worden aangedreven door differentiërende factoren, voornamelijk schildklierhormoon (TH), in een gesynchroniseerd proces3 dat ertoe leidt dat de OPC specifieke stimuli herkent en erop reageert die proliferatie veroorzaken, migratie naar het niet-gemyeliniseerde axon en differentiatie in volwassen OK’s die op hun beurt de myelineschede ontwikkelen4. Al deze processen worden fijn aangestuurd en vinden plaats in een complexe omgeving.
Vanwege de complexe aard van myelinisatie, remyelinisatie en demyelinisatiegebeurtenissen, is er een grote behoefte aan een vereenvoudigde en betrouwbare in vitro methode om de onderliggende mechanismen te bestuderen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, gericht op de belangrijkste cellulaire speler: de OPC5.
Om een in vitro systeem betrouwbaar te laten zijn, moet rekening worden gehouden met een aantal factoren: de complexiteit van de cellulaire omgeving, leeftijdsgebonden celintrinsieke verschillen, fysiologische TH-gemedieerde differentiatie, pathologische mechanismen en de robuustheid van de gegevens6. Inderdaad, de onvervulde behoefte in het veld is een model dat de complexiteit van de in vivo toestand nabootst, niet met succes bereikt door het gebruik van geïsoleerde zuivere OPC-culturen. Bovendien hebben de twee belangrijkste componenten van demyeliniserende gebeurtenissen, ontsteking en hypoxie / ischemie (HI), direct betrekking op andere celcomponenten die indirect de fysiologische differentiatie en rijping van OPC’s kunnen beïnvloeden, een aspect dat niet kan worden bestudeerd in overgesimplificeerde in vitro modellen.
Uitgaande van een sterk voorspellend cultuursysteem, is de volgende en meer algemene uitdaging de productie van robuuste en betrouwbare gegevens. In deze context is celgebaseerde high-content screening (HCS) de meest geschikte techniek7, omdat ons doel ten eerste is om de hele cultuur in een automatische workflow te analyseren, waarbij de vertekening van het kiezen van representatieve velden wordt vermeden, en ten tweede om de automatische en gelijktijdige generatie van op beeldvorming gebaseerde gegevens met een hoog gehalte te verkrijgen8.
Aangezien de belangrijkste behoefte is om de beste balans te bereiken tussen in vitro vereenvoudiging en in vivo-nabootsende complexiteit, presenteren we hier een zeer reproduceerbare methode voor het verkrijgen van OPC’s afgeleid van neurale stamcellen (NSC’s) geïsoleerd uit de foetale voorhersenen en de volwassen subventrikelzone (SVZ). Dit in vitro model omvat het gehele OPC-differentiatieproces, van multipotent NSC tot volwassen/myeliniserend OL, op een fysiologische TH-afhankelijke manier. De resulterende cultuur is een dynamisch differentiërend/rijpend systeem dat resulteert in een spontane co-cultuur die voornamelijk bestaat uit differentiërende OPC’s en astrocyten, met een laag percentage neuronen. Deze primaire cultuur bootst de complexe in vivo omgeving beter na, terwijl de stamcelafleiding eenvoudige manipulaties mogelijk maakt om de gewenste cellijnverrijking te verkrijgen.
In tegenstelling tot andere screeningstrategieën voor geneesmiddelen met behulp van cellijnen of zuivere culturen van primaire OPC’s, maakt de hier beschreven methode de studie mogelijk van het effect van pathologische interferenten of therapeutische moleculen in een complexe omgeving, zonder de focus op het gewenste celtype te verliezen. De beschreven HCS-workflow maakt een analyse van de levensvatbaarheid van cellen en afstammingsspecificaties mogelijk, evenals afstammingsspecifieke celdood en morfologische parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
De complexe aard van myelinisatie/remyelinisatieprocessen en demyeliniserende gebeurtenissen maakt de ontwikkeling van voorspellende in vitro systemen uiterst uitdagend. De meest gebruikte screeningsystemen voor in vitro geneesmiddelen zijn meestal menselijke cellijnen of primaire zuivere OL-culturen, met toenemend gebruik van complexere coculturen of organotypische systemen15. Zelfs als dergelijke systemen worden gekoppeld aan technologieën met een hoog gehalte, blijven pure OL-culturen de voork…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), en Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Speciale dank aan Stichting IRET voor het hosten van het experimentele werk.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
