בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים
Summary
אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.
Abstract
המשוכה העיקרית בפיתוח טכניקות סינון תרופות להערכת היעילות של אסטרטגיות טיפוליות במחלות מורכבות היא איזון בין פישוט במבחנה לבין יצירה מחדש של סביבת vivo המורכבת, יחד עם המטרה העיקרית, המשותפת לכל אסטרטגיות הסינון, של השגת נתונים חזקים ואמינים, הצפויים מאוד לתרגום in vivo.
בתחום המחלות demyelinating, רוב אסטרטגיות סינון התרופה מבוססות על קווי תאים מונצחים או תרבויות טהורות של תאים מקדימים oligodendrocyte ראשוני מבודד (OPCs) מבעלי חיים שזה עתה נולדו, המובילים להטיות חזקות בשל היעדר הבדלים הקשורים לגיל וכל מצב או מורכבות פתולוגיים אמיתיים.
כאן אנו מראים את ההתקנה של מערכת במבחנה שמטרתה מודל ההבחנה הפיזיולוגית / התבגרות של תאי גזע עצביים (NSC) נגזר OPCs, מניפולציה בקלות כדי לחקות תנאים פתולוגיים האופייניים demyelinating מחלות. יתר על כן, השיטה כוללת בידוד ממוחות עובריים ומבוגרים, המעניקה מערכת המבדילה באופן דינמי מ- OPCs לאוליגודנדרוציטים בוגרים (OLs) בתרבות משותפת ספונטנית הכוללת גם אסטרוציטים. מודל זה דומה מבחינה פיזיולוגית המיאלינציה בתיווך הורמון בלוטת התריס ותהליך תיקון המיאלין, המאפשר תוספת של מפריעים פתולוגיים אשר מודל מנגנוני המחלה. אנו מראים כיצד לחקות את שני המרכיבים העיקריים של מחלות demyelinating (כלומר, היפוקסיה / איסכמיה ודלקת), לשחזר את השפעתם על מיאלינציה התפתחותית ותיקון מיאלין למבוגרים ולקחת בחשבון את כל רכיבי התא של המערכת לאורך כל הדרך, תוך התמקדות בהבחנה OPCs.
מודל מעורב ספונטני זה, יחד עם טכנולוגיות סינון בעלות תוכן גבוה המבוססות על תאים, מאפשר פיתוח של מערכת סינון תרופות חזקה ואמינה לאסטרטגיות טיפוליות שמטרתן להילחם בתהליכים הפתולוגיים המעורבים בדמיאלינציה ובזירוז מינלין.
Introduction
במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), מיאלין יוצר תאים (אוליגודנדרוציטים, OLs) ומבשריהם (תאי מבשרי אוליגודנדרוציטים, OPCs) אחראים על מיאלינציה התפתחותית, תהליך המתרחש בתקופות פרי- ופוסט לידה, ועל מחזור ותיקון מיאלין (remyelination) בבגרות1. תאים אלה הם מיוחדים מאוד, אינטראקציה אנטומית ותפקודית עם כל שאר הרכיבים גליה נוירונים, מה שהופך אותם לחלק בסיסי של מבנה ותפקוד CNS.
Demyelinating אירועים מעורבים פציעות מערכת חולים שונות ומחלות2, ופועלים בעיקר על OPCs ו OLs באמצעות מנגנונים רב-גורמיים, הן במהלך הפיתוח והן בבגרות. המבשרים הלא מובחנים מונעים על ידי גורמים מבדילים, בעיקר הורמון בלוטת התריס (TH), בתהליך מסונכרן3 שמוביל את OPC לזהות ולהגיב לגירויים ספציפיים הגורמים להתפשטות, הגירה לאקסון הלא מיאלין, ובידול ל- OLs בוגר אשר בתורו לפתח את נדן המיאלין4. כל התהליכים הללו נשלטים בקפידה ומתרחשים בסביבה מורכבת.
בשל האופי המורכב של מיאלינציה, רמיאלינציה ואירועי demyelination, יש צורך גדול בשיטת במבחנה פשוטה ואמינה ללמוד את המנגנונים הבסיסיים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, תוך התמקדות בנגן הסלולר העיקרי: OPC5.
כדי שמערכת הפריה תהיה אמינה, יש לקחת בחשבון מספר גורמים: המורכבות של הסביבה התאית, הבדלים מהותיים הקשורים לגיל, בידול פיזיולוגי בתיווך TH, מנגנונים פתולוגיים, ואת החוסן של הנתונים6. ואכן, הצורך הבלתי ממומש בתחום הוא מודל המחקה את המורכבות של מצב in vivo, שלא הושג בהצלחה באמצעות תרבויות OPC טהורות מבודדות. בנוסף, שני המרכיבים העיקריים של demyelinating אירועים, דלקת היפוקסיה / איסכמיה (HI), ישירות לערב רכיבי תאים אחרים שעשויים להשפיע בעקיפין על ההבחנה הפיזיולוגית וההתבגרות של OPCs, היבט אשר לא ניתן ללמוד במודלים במבחנה פשוטה מדי.
החל ממערכת תרבות חזויה ביותר, האתגר הבא והכלל יותר הוא ייצור נתונים חזקים ואמינים. בהקשר זה, סינון תוכן גבוה מבוסס תא (HCS) היא הטכניקה המתאימה ביותר7, שכן המטרה שלנו היא ראשית לנתח את התרבות כולה בזרימת עבודה אוטומטית, הימנעות ההטיה של בחירת שדות מייצגים, ושנית להשיג את הדור האוטומטי ובו זמנית של נתונים מבוססי תוכן גבוה מבוסס הדמיה8.
בהתחשב בכך שהצורך העיקרי הוא להשיג את האיזון הטוב ביותר בין פישוט במבחנה לבין מורכבות חיקוי ויוו, כאן אנו מציגים שיטה הניתנת לשחזור גבוהה להשגת OPCs הנגזרים מתאי גזע עצביים (NSCs) המבודדים מהבם החזה העוברי והאזור התת חדרי למבוגרים (SVZ). מודל מבחנה זה מקיף את כל תהליך הבידול של OPC, מ- NSC רב-תכליתי ועד OL בוגר / מיאלינציאלי, באופן פיזיולוגי התלוי ב- TH. התרבות המתקבלת היא מערכת מבדילה/התבגרות דינמית, אשר גורמת לתרבות משותפת ספונטנית המורכבת בעיקר מ- OPCs ואסטרוציטים מבדילים, עם אחוז נמוך של נוירונים. תרבות ראשונית זו מחקה טוב יותר את הסביבה המורכבת של vivo, בעוד נגזרת תאי הגזע שלה מאפשרת לבצע מניפולציות פשוטות כדי להשיג את העשרת שושלת התא הרצויה.
בניגוד לאסטרטגיות אחרות של סינון תרופות באמצעות קווי תאים או תרביות טהורות של OPCs ראשוניים, השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחקור את ההשפעה של מפריעים פתולוגיים או מולקולות טיפוליות בסביבה מורכבת, מבלי לאבד את ההתמקדות בסוג התא הרצוי. זרימת העבודה של HCS המתוארת מאפשרת ניתוח של כדאיות התא ומפרט שושלת היוחן, כמו גם מוות תאים ספציפיים לשושלת היוחוס ופרמטרים מורפולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
האופי המורכב של תהליכי מיאלינציה/רמיאלינציה ואירועים דמיאלינטיים הופכים את התפתחותן של מערכות במבחנה לניבוי מאתגרת ביותר. מערכות סינון התרופות במבחנה הנפוצות ביותר הן בעיקר קווי תאים אנושיים או תרביות OL טהורות ראשוניות, עם שימוש גובר בתרבויות משותפות מורכבות יותר או במערכות אורגנוטיפי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי אשכולות הטכנולוגיה הלאומיים של MIURהצגת IRMI (CTN01_00177_888744) ואזור אמיליה-רומאניה, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
תודה מיוחדת לקרן IRET על אירוח העבודה הניסיונית.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
