Скрининг с высоким содержанием скрининговой дифференцировки и анализа созревания культур клеток-предшественников олигодендроцитов, полученных из нервных стволовых клеток
Summary
Описано производство смешанных культур астроцитов и клеток-предшественников олигодендроцитов, полученных из фетальных или взрослых нервных стволовых клеток, дифференцирующихся в зрелые олигодендроциты, и моделирование in vitro вредных раздражителей. Соединение с клеточной техникой скрининга с высоким содержанием создает надежную и надежную систему скрининга лекарств.
Abstract
Основным препятствием в разработке методов скрининга лекарств для оценки эффективности терапевтических стратегий при сложных заболеваниях является достижение баланса между упрощением in vitro и воссозданием сложной среды in vivo, наряду с основной целью, общей для всех стратегий скрининга, получение надежных и надежных данных, высоко прогностических для трансляции in vivo.
В области демиелинизирующих заболеваний большинство стратегий скрининга лекарств основаны на увековеченных клеточных линиях или чистых культурах изолированных первичных клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) новорожденных животных, что приводит к сильным предубеждениям из-за отсутствия возрастных различий и любого реального патологического состояния или сложности.
Здесь мы показываем установку системы in vitro, направленной на моделирование физиологической дифференцировки/созревания OPC, полученных из нервных стволовых клеток (NSC), которыми легко манипулировать, чтобы имитировать патологические состояния, типичные для демиелинизирующих заболеваний. Кроме того, метод включает изоляцию от мозга плода и взрослого человека, давая систему, которая динамически дифференцируется от OPC к зрелым олигодендроцитам (OL) в спонтанной кокультуре, которая также включает астроциты. Эта модель физиологически напоминает опосредованную гормонами щитовидной железы миелинизацию и процесс восстановления миелина, что позволяет добавлять патологические интерференты, которые моделируют механизмы заболевания. Мы показываем, как имитировать два основных компонента демиелинизирующих заболеваний (т.е. гипоксию/ишемию и воспаление), воссоздавая их влияние на развитие миелинизации и восстановление миелина у взрослых и принимая во внимание все клеточные компоненты системы, уделяя особое внимание дифференциации OPC.
Эта спонтанная смешанная модель в сочетании с клеточными технологиями скрининга с высоким содержанием позволяет разработать надежную и надежную систему скрининга лекарств для терапевтических стратегий, направленных на борьбу с патологическими процессами, связанными с демиелинизацией, и на индуцирование ремиелинизации.
Introduction
В центральной нервной системе (ЦНС) миелинообразующие клетки (олигодендроциты, ОЛС) и их предшественники (клетки-предшественники олигодендроцитов, ОПК) отвечают за развитие миелинизации, процесс, который происходит в пери- и послеродовой периоды, и за оборот и восстановление миелина (ремиелинизацию) во взросломвозрасте1. Эти клетки являются высокоспециализированными, взаимодействуя анатомически и функционально со всеми другими глиальными и нейронными компонентами, что делает их фундаментальной частью структуры и функции ЦНС.
Демиелинизирующие события участвуют в различных травмах и заболеваниях ЦНС2и в основном действуют на OPC и OL посредством многофакторных механизмов, как во время развития, так и во взрослой жизни. Недифференцированные предшественники обусловлены дифференцирующими факторами, главным образом гормоном щитовидной железы (TH), в синхронизированном процессе3, который заставляет OPC распознавать и реагировать на специфические стимулы, которые индуцируют пролиферацию, миграцию к немиелинизированному аксону и дифференцировку в зрелые OL, которые, в свою очередь, развивают миелиновую оболочку4. Все эти процессы тонко контролируются и происходят в сложной среде.
Из-за сложного характера событий миелинизации, ремиелинизации и демиелинизации существует большая потребность в упрощенном и надежном методе in vitro для изучения основных механизмов и разработки новых терапевтических стратегий, ориентированных на основного клеточного игрока: OPC5.
Чтобы система in vitro была надежной, необходимо учитывать ряд факторов: сложность клеточной среды, возрастные клеточные внутренние различия, физиологическая TH-опосредованная дифференциация, патологические механизмы и надежность данных6. Действительно, неудовлетворенная потребность в этой области является моделью, которая имитирует сложность состояния in vivo, не успешно достигнутую за счет использования изолированных чистых культур OPC. Кроме того, два основных компонента демиелинизирующих событий, воспаление и гипоксия / ишемия (HI), непосредственно связаны с другими клеточными компонентами, которые могут косвенно влиять на физиологическую дифференцировку и созревание OPC, аспект, который не может быть изучен в чрезмерно упрощенных моделях in vitro.
Начиная с высокопрогностической системы культуры, последующей и более общей задачей является получение надежных и надежных данных. В этом контексте клеточный скрининг с высоким содержанием (HCS) является наиболее подходящим методом7,поскольку наша цель состоит в том, чтобы, во-первых, проанализировать всю культуру в автоматическом рабочем процессе, избегая смещения выбора репрезентативных полей, и, во-вторых, получить автоматическую и одновременную генерацию данных с высоким содержанием изображений8.
Учитывая, что основная потребность заключается в достижении наилучшего баланса между упрощением in vitro и сложностью in vivo-mimicing, здесь мы представляем высоковоспроизводимый метод получения OPC, полученных из нервных стволовых клеток (NSC), выделенных из переднего мозга плода и взрослой субвентрикулярной зоны (SVZ). Эта модель in vitro охватывает весь процесс дифференцировки OPC, от мультипотентного NSC до зрелого / миелинизирующего OL, физиологическим TH-зависимым образом. Полученная культура представляет собой динамически дифференцирующуюся/созревающую систему, которая приводит к спонтанной кокультуре, состоящей в основном из дифференцированных OPC и астроцитов, с низким процентом нейронов. Эта первичная культура лучше имитирует сложную среду in vivo, в то время как ее получение стволовых клеток позволяет выполнять простые манипуляции для получения желаемого обогащения клеточной линии.
В отличие от других стратегий скрининга лекарств с использованием клеточных линий или чистых культур первичных OPC, описанный здесь метод позволяет изучать влияние патологических интерферентов или терапевтических молекул в сложной среде, не теряя фокуса на желаемом типе клеток. Описанный рабочий процесс HCS позволяет анализировать жизнеспособность клеток и спецификацию родословной, а также специфическую для линии клеточную гибель и морфологические параметры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сложный характер процессов миелинизации/ремиелинизации и демиелинизирующих событий делает разработку прогностических систем in vitro чрезвычайно сложной. Наиболее широко используемыми системами скрининга лекарственных средств in vitro являются в основном клеточные линии человека или пе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
При поддержке проекта MIUR National Technology Clusters project IRMI (CTN01_00177_888744) и Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Отдельное спасибо Фонду IRET за проведение экспериментальной работы.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
