Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa
Summary
Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.
Abstract
Caracterizar a estrutura de alta ordem de uma proteína é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa (MS) emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar a estrutura de uma proteína por MS, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica as informações estruturais de uma proteína em sua massa. Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente cadeias laterais de aminoácidos acessíveis de solvente. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de diethylpirocarbonato (DEPC) como um reagente de rotulagem covalente juntamente com a detecção de MS. O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso junto com a MS para obter informações estruturais para pequenas proteínas de domínio único, como β2-microglobulina, para grandes proteínas multi-domínio, como anticorpos monoclonais.
Introduction
Proteínas são biomoléculas essenciais em praticamente todos os processos fisiológicos. A variedade de funções que as proteínas realizam são possíveis devido às estruturas que adotam e às interações que têm com outras biomoléculas. Para entender a função proteica em um nível mais profundo, ferramentas bioquímicas e biofísicas são necessárias para elucidar essas importantes características e interações estruturais. Tradicionalmente, a cristalografia de raios-X, a microscopia eletrônica criogênica e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) forneceram o detalhe desejado do nível atômico para revelar a estrutura proteica. No entanto, inúmeros sistemas proteicos não podem ser interrogados por essas técnicas devido ao mau comportamento de cristalização, disponibilidade limitada de proteínas, heterogeneidade excessiva da amostra ou limitações de peso molecular. Consequentemente, surgiram novos métodos de análise que superam essas limitações. Entre as técnicas emergentes que podem fornecer informações estruturais proteicas está a espectrometria de massa.
A espectrometria de massa (MS) mede a relação massa-carga (m/z) de uma molécula, de modo que informações estruturais de alta ordem proteica devem ser obtidas codificando as informações estruturais desejadas na massa da proteína. Várias abordagens para codificar essas informações foram desenvolvidas, incluindo troca de deutério de hidrogênio (HDX)1,2,3,4, crosslinking químico (XL)5,6, e rotulagem covalente (CL)7,8,9,10. Em HDX, os hidrogênios de amido de espinha dorsal são trocados por deutérios ligeiramente mais massivos a taxas que dependem da acessibilidade solvente e da extensão de ligação H. A extensão do HDX pode ser localizada digerindo rapidamente a proteína em fragmentos de peptídeos antes de separar e medir esses fragmentos pelo espectrômetro de massa ou dissolvendo a proteína em um experimento de cima para baixo. Determinar a taxa de câmbio fornece mais informações sobre a dinâmica das proteínas. A HDX provou ser uma ferramenta valiosa para caracterizar a estrutura proteica, apesar dos desafios associados à troca traseira e da necessidade de equipamentos especializados para maximizar a reprodutibilidade. No XL-MS, as proteínas são reagidas com reagentes bifuncionais que ligam covalentemente cadeias laterais de resíduos dentro de uma determinada proteína ou entre duas proteínas. Ao fazer isso, o XL-MS pode fornecer restrições de distância que podem ser usadas para caracterizar a estrutura proteica. As regiões da proteína que estão cruzadas podem ser identificadas pela digestão proteolítica seguida de cromatografia líquida (LC)-MS. Embora o XL-MS seja uma ferramenta versátil que tem sido usada para estudar uma variedade de complexos proteicos, incluindo células internas, a identificação dos produtos XL é desafiadora e requer software especializado.
O CL-MS emergiu recentemente como uma ferramenta complementar e às vezes alternativa baseada em MS para estudar a estrutura e as interações proteicas. Em CL-MS, um complexo proteico ou proteico é covalentemente modificado com um reagente monofuncional que pode reagir com cadeias laterais expostas a solventes(Figura 1). Comparando as extensões de modificação de um complexo proteico ou proteico em diferentes condições, mudanças de conformação, locais de ligação e interfaces proteína-proteína podem ser reveladas. Após a reação cl, informações específicas do local, muitas vezes no nível único de aminoácidos, podem ser obtidas usando fluxos de trabalho típicos de proteômica de baixo para cima em que as proteínas são digeridas proteolíticos, fragmentos de peptídeos são separados por LC e locais modificados são identificados usando ms tandem (MS/MS). A rica história da química bioconjugada disponibilizou numerosos reagentes para experimentos cl-ms. Os reagentes CL se enquadram em duas categorias gerais: (i) específicas e (ii) não específicas. Reagentes específicos reagem com um único grupo funcional (por exemplo, aminas livres)8,10 e são fáceis de implementar, mas tendem a fornecer informações estruturais limitadas. Reagentes não específicos reagem com uma ampla gama de cadeias laterais, mas muitas vezes requerem equipamentos especializados, como lasers ou fontes síncrotrons para produzir essas espécies altamente reativas. Os radicais hidroxil são os reagentes não específicos mais utilizados, tendo sido aplicados em pegada radical hidroxil (HRF)7,11,12,13 experimentos para estudar uma ampla gama de proteínas e complexos proteicos sob uma variedade de condições.
Nosso grupo de pesquisa utilizou com sucesso outro reagente relativamente não específico chamado dietilpiroto (DEPC) para estudar estrutura proteica e interações no contexto dos experimentos cl-ms14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. O DEPC oferece a simplicidade de reagentes de rotulagem específicos (ou seja, nenhum equipamento especializado é necessário para realizar as reações), ao mesmo tempo em que reage com até 30% dos aminoácidos na proteína média. Como um reagente altamente eletrofílico, o DEPC é capaz de reagir com os resíduos n-terminus e as cadeias laterais nucleofílicas de cisteína, histidina, lise, tyrosina, serina e resíduos de threonina. Normalmente, um único produto dessas reações é gerado, resultando em um aumento em massa de 72,02 Da. Este único tipo de produto contrasta com os até 55 produtos diferentes que podem ser produzidos quando as proteínas reagem com radicais hidroxil7. Tal química simples facilita a identificação de locais rotulados.
Aqui, fornecemos protocolos para o uso do CL-MS baseado em DEPC para estudar estrutura e interações proteicas. Detalhes associados à preparação de reagentes, reações de proteínas DEPC, condições de digestão proteica, parâmetros LC-MS e MS/MS e análise de dados são descritos. Também demonstramos a utilidade da rotulagem DEPC, fornecendo exemplos de interações proteína-metal, proteína-ligante e proteína-proteína, bem como proteínas submetidas a mudanças estruturais após o aquecimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos
Vários pontos relativos ao design experimental devem ser considerados para garantir resultados confiáveis de rotulagem. Primeiro, para maximizar a rotulagem de proteínas, é necessário evitar buffers com grupos fortemente nucleofílicos (por exemplo, Tris) porque eles podem reagir com o DEPC e diminuir a extensão da rotulagem. Também é concebível que tais tampões possam reagir com resíduos rotulados, causando a remoção do rótulo e, portanto, a perda de informações estruturais. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o Grant R01 GM075092. O espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Fusion usado para adquirir alguns dos dados aqui descritos foi adquirido com recursos do Instituto Nacional de Saúde s10OD010645.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
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