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Chemistry

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

Published: June 15, 2021
doi:
10.3791/61983
, , ,
1Department of Chemistry,University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program,University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences,Chulalongkorn University

Summary

質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。

Abstract

タンパク質の高次構造を特徴付けて、その機能を理解するためには不可欠です。質量分析(MS)は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。MSによるタンパク質の構造を研究するために、タンパク質の構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われます。特に効果的なアプローチの1つは、溶媒のアクセス可能なアミノ酸側鎖を共有的に修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベルの分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、MS検出と共に共有標識試薬としてのジエチルピロカーボネート(DEPC)の使用に関連するプロトコルについて説明する。DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより優れた構造分解能を提供する。DEPCはMSと共に、β2-ミクログロブリンなどの小さな単一ドメインタンパク質の構造情報をモノクローナル抗体などの大きな多ドメインタンパク質に対して得るのに成功しています。

Introduction

タンパク質は、事実上すべての生理学的プロセスにおいて不可欠な生体分子です。タンパク質が採用する構造と他の生体分子との相互作用のために、タンパク質が果たす様々な機能が可能です。タンパク質の機能を深く理解するためには、これらの重要な構造特徴と相互作用を解明するために生化学的および生物物理学的ツールが必要です。従来、X線結晶学、極低温電子顕微鏡、核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質構造を明らかにするために所望の原子レベルの詳細を提供してきました。しかし、結晶化の挙動、タンパク質の入手可能性の制限、過剰なサンプルの不均一性、分子量の制限など、これらの手法では、多数のタンパク質システムを問い合せることはできません。その結果、これらの制限を克服する新しい分析方法が登場しました。タンパク質の構造情報を提供できる新たな技術の中には、質量分析があります。

質量分析(MS)は分子の質量電荷(m/z)比を測定するため、所望の構造情報をタンパク質の質量にコードすることにより、タンパク質の高次構造情報を取得する必要があります。この情報をコード化するためのいくつかのアプローチは、水素重水素交換(HDX)1、2、3、4、化学架橋(XL)5、6、および共有結合標識(CL)7、8、9、10を含む開発された。HDXでは、溶媒の入手可能性とH結合の範囲に依存する速度でわずかに大きい重水素によって、骨格アミド水素が交換されます。HDXの範囲は、タンパク質をペプチド断片に素早く消化してから、質量分析計でこれらの断片を分離して測定するか、またはトップダウン実験でタンパク質を解離することによって局在化することができる。交換速度を決定することで、タンパク質のダイナミクスに関するさらなる洞察が得られます。HDXは、バック交換に伴う課題や、再現性を最大限に高める特殊な機器の必要性にも関わらず、タンパク質構造を特徴付けるための貴重なツールであることが証明されています。XL-MSでは、タンパク質は、特定のタンパク質内または2つのタンパク質間で隣接する残基側鎖を共有結合する二機能性試薬と反応する。その際、XL-MSは、タンパク質構造を特徴付けるために使用できる距離制約を提供することができます。架橋されたタンパク質の領域は、タンパク質分解消化と続く液体クロマトグラフィー(LC)-MS分析によって同定することができる。XL-MSは、細胞内を含む様々なタンパク質複合体を研究するために使用されてきた汎用性の高いツールですが、XL製品の同定は困難であり、特殊なソフトウェアが必要です。

CL-MSは、タンパク質の構造と相互作用を研究するための補完的で、時には代替MSベースのツールとして最近登場しました。CL-MSにおいて、タンパク質またはタンパク質複合体は、溶媒暴露側鎖と反応し得る単一機能試薬で共有修飾される(図1)。異なる条件下でタンパク質またはタンパク質複合体の修飾範囲を比較することにより、立体構造変化、結合部位、およびタンパク質-タンパク質のインターフェースが明らかになる。CL反応後、部位特異的情報は、多くの場合、単一アミノ酸レベルで、タンパク質がタンパク質分解され、ペプチド断片がLCによって分離され、改変部位がタンデムMS(MS/MS)を使用して同定される典型的なボトムアッププロテオミクスワークフローを使用して得ることができる。バイオコンジュゲート化学の豊富な歴史により、CL-MS実験に数多くの試薬が利用可能になりました。CL試薬は、(i)特異的および(ii)非特異的の2つの一般的なカテゴリーに分類される。特定の試薬は、単一の官能基(例えば、遊離アミン)8、10と反応し、実装が容易であるが、それらは限られた構造情報を提供する傾向がある。非特異的試薬は、広範囲の側鎖と反応しますが、多くの場合、これらの反応性の高い種を生成するためにレーザーやシンクロトロン源などの特殊な機器が必要です。ヒドロキシルラジカルは、最も一般的に使用される非特異的試薬であり、ヒドロキシルラジカルフットプリント(HRF)7、11、12、13実験を行い、様々な条件下で幅広いタンパク質およびタンパク質複合体を研究した。

我々の研究グループは、CL-MS実験14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25の文脈におけるタンパク質構造および相互作用を研究するために、ジエチルピロカーボネート(DEPC)と呼ばれる別の比較的非特異的な試薬を使用することに成功した。DEPCは、特定の標識試薬のシンプルさを提供し(すなわち、反応を行うために特別な装置は必要ありません)、一方で、平均タンパク質中のアミノ酸の最大30%と反応します。高い電気反応試薬として、DEPCはシステイン、ヒスチジン、リジン、チロシン、セリン、スレオニン残基のN末端および求核側鎖と反応することができる。典型的には、これらの反応の単一の産物が生成され、結果として72.02Daの質量増加が生じる。この単一タイプの製品は、タンパク質がヒドロキシルラジカルと反応するときに生成することができる最大55種類の製品と対比する7。このような単純な化学は、標識された部位の同定を容易にする。

ここでは、DEPCベースのCL-MSを用いてタンパク質の構造と相互作用を研究するためのプロトコルを提供します。試薬調製、DEPC-タンパク質反応、タンパク質消化条件、LC-MSおよびMS/MSパラメータ、およびデータ分析に関連する詳細が記載されています。また、タンパク質-金属、タンパクリガンド、タンパク質-タンパク質相互作用、加熱時に構造変化を起こしているタンパク質の結果の例を提供することで、DEPC標識の有用性を実証します。

Protocol

1. タンパク質および試薬の調製 注: このプロトコルには、DEPC でタンパク質を標識するワークフローの例が含まれています。一部の条件および試薬濃度は、選択したタンパク質に基づいて異なる場合があります。 1.5 mLマイクロ遠心チューブですべての試薬溶液を調製します。 pH 7.4で所望の濃度のタンパク質溶液を、通常は数十μMの範囲で10 mM 3-(N-モルフォ?…

Representative Results

DEPC 変更サイトと変更率の特定共有結合標識による質量付加は、(a)インタクトタンパク質及び(b)ペプチドレベル8,9で測定することができる。無傷レベルでは、標識数の異なるタンパク質種の分布を、直接分析またはLC-MSの標識タンパク質サンプルから得ることができます。より高い分解能構造情報(すなわち、部位特異的標識データ)を得る?…

Discussion

重要なステップ
実験計画に関するいくつかの点を考慮して、信頼性の高いラベル作成結果を確保する必要があります。まず、タンパク質標識を最大化するためには、DEPCと反応して標識の程度を低下させることができるため、強い求核基(例えば、Tris)を有する緩衝液を避ける必要がある。また、このようなバッファーが標識残基と反応し、ラベルの除去を引き起こし、したがって構?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、グラントR01 GM075092の下で国立衛生研究所(NIH)からの支援を認めている。ここで説明したデータの一部を取得するために使用されるサーモオービトラップ核質量分析計は、国立衛生研究所の助成金S10OD010645からの資金で取得されました。

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706
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Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).
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