Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie
Summary
De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.
Abstract
Het karakteriseren van de hogere ordestructuur van een eiwit is essentieel voor het begrijpen van de functie ervan. Massaspectrometrie (MS) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor dit doel, vooral voor eiwitsystemen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele methoden. Om de structuur van een eiwit door MS te bestuderen, worden specifieke chemische reacties uitgevoerd in een oplossing die de structurele informatie van een eiwit in zijn massa codeert. Een bijzonder effectieve aanpak is het gebruik van reagentia die covalent oplosmiddel toegankelijke aminozuur zijketens wijzigen. Deze reacties leiden tot massatoestijgingen die kunnen worden gelokaliseerd met een resolutie op residuniveau in combinatie met proteolytische spijsvertering en tandemmassaspectrometrie. Hier beschrijven we de protocollen die verband houden met het gebruik van diethylpyrocarbonaat (DEPC) als een covalent labelend reagens samen met MS-detectie. DEPC is een zeer elektrofiele molecule die tot 30% van de residuen in het gemiddelde eiwit kan labelen, waardoor een uitstekende structurele resolutie wordt geboden. DEPC is met succes samen met MS gebruikt om structurele informatie te verkrijgen voor kleine single-domain eiwitten, zoals β2-microglobuline, voor grote multidomeineiwitten, zoals monoklonale antilichamen.
Introduction
Eiwitten zijn essentiële biomoleculen in vrijwel elk fysiologisch proces. De verscheidenheid aan functies die eiwitten uitvoeren, is mogelijk vanwege de structuren die ze aannemen en de interacties die ze hebben met andere biomoleculen. Om de eiwitfunctie op een dieper niveau te begrijpen, zijn biochemische en biofysische hulpmiddelen nodig om deze belangrijke structurele kenmerken en interacties op te helderen. Traditioneel hebben röntgenkristallografie, cryogene elektronenmicroscopie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie het gewenste atoomniveaudetail opgeleverd om de eiwitstructuur te onthullen. Talrijke eiwitsystemen kunnen echter niet door deze technieken worden ondervraagd vanwege slecht kristallisatiegedrag, beperkte eiwitbeschikbaarheid, overmatige monster heterogeniteit of moleculaire gewichtsbeperkingen. Bijgevolg zijn er nieuwere analysemethoden ontstaan die deze beperkingen overwinnen. Een van de opkomende technieken die eiwit structurele informatie kan leveren is massaspectrometrie.
Massaspectrometrie (MS) meet de massa-op-ladingverhouding (m/z) van een molecuul, dus eiwit hogere orde structurele informatie moet worden verkregen door de gewenste structurele informatie te coderen in de massa van het eiwit. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om deze informatie te coderen, waaronder waterstof-deuteriumuitwisseling (HDX)1,2,3,4, chemische crosslinking (XL)5,6en covalente etikettering (CL)7,8,9,10. In HDX worden backboneamidewaterstofen uitgewisseld door iets massievere deuteriums tegen snelheden die afhankelijk zijn van de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de mate van H-binding. De omvang van HDX kan worden gelokaliseerd door het eiwit snel te verteren tot peptidefragmenten voordat deze fragmenten worden gescheiden en gemeten door de massaspectrometer of door het eiwit te scheiden in een top-down experiment. Het bepalen van de wisselkoers geeft meer inzicht in eiwitdynamiek. HDX heeft bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn voor het karakteriseren van de eiwitstructuur, ondanks uitdagingen in verband met ruguitwisseling en de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur om de reproduceerbaarheid te maximaliseren. Bij XL-MS worden eiwitten gereageerd met bi-functionele reagentia die naast elkaar vloeiende residuzijdeketens binnen een bepaald eiwit of tussen twee eiwitten met elkaar verbinden. Daarbij kan XL-MS afstandsbeperkingen bieden die kunnen worden gebruikt om de eiwitstructuur te karakteriseren. De gebieden van het eiwit die met elkaar verbonden zijn, kunnen worden geïdentificeerd door proteolytische spijsvertering gevolgd door vloeistofchromatografie (LC)-MS-analyse. Hoewel XL-MS een veelzijdig hulpmiddel is dat is gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitcomplexen te bestuderen, waaronder in cellen, is de identificatie van de XL-producten een uitdaging en vereist het gespecialiseerde software.
CL-MS is onlangs naar voren gekomen als een aanvullend en soms alternatief op MS gebaseerd hulpmiddel om eiwitstructuur en interacties te bestuderen. Bij CL-MS wordt een eiwit- of eiwitcomplex covalent gewijzigd met een monofunctioneel reagens dat kan reageren met aan oplosmiddel blootgestelde zijketens (figuur 1). Door de modificatieomvang van een eiwit- of eiwitcomplex onder verschillende omstandigheden te vergelijken, kunnen conformatieveranderingen, bindingsplaatsen en eiwit-eiwitinterfaces worden onthuld. Na de CL-reactie kan sitespecifieke informatie, vaak op het niveau van één aminozuur, worden verkregen met behulp van typische bottom-up proteomics-workflows waarin eiwitten proteolytisch worden verteerd, peptidefragmenten worden gescheiden door LC en gemodificeerde locaties worden geïdentificeerd met behulp van tandem-MS (MS/MS). De rijke geschiedenis van bioconjugaatchemie heeft tal van reagentia beschikbaar gemaakt voor CL-MS-experimenten. CL-reagentia vallen in twee algemene categorieën: i) specifiek en ii) niet-specifiek. Specifieke reagentia reageren met één functionele groep (bijv. vrije aminen)8,10 en zijn gemakkelijk te implementeren, maar ze hebben de neiging om beperkte structurele informatie te verstrekken. Niet-specifieke reagentia reageren met een breed scala aan zijketens, maar vereisen vaak gespecialiseerde apparatuur zoals lasers of synchrotronbronnen om deze zeer reactieve soorten te produceren. Hydroxylradicalen zijn het meest gebruikte niet-specifieke reagens, dat is toegepast in hydroxylradicalenvoetafdruk (HRF)7,11,12,13 experimenten om een breed scala aan eiwitten en eiwitcomplexen onder verschillende omstandigheden te bestuderen.
Onze onderzoeksgroep heeft met succes een ander relatief niet-specifiek reagens genaamd diethylpyrocarbonaat (DEPC) gebruikt om eiwitstructuur en interacties te bestuderen in de context van CL-MS-experimenten14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC biedt de eenvoud van specifieke etiketteerreagentia (d.w.z. er is geen gespecialiseerde apparatuur nodig om de reacties uit te voeren), terwijl het reageert met maximaal 30% van de aminozuren in het gemiddelde eiwit. Als een zeer elektrofiele reagens is DEPC in staat om te reageren met de N-terminus en de nucleofiele zijketens van cysteïne, histidine, lysine, tyrosine, serine en threonineresiduen. Meestal wordt een enkel product van deze reacties gegenereerd, wat resulteert in een massatoename van 72,02 Da. Dit ene type product staat in contrast met de tot 55 verschillende producten die kunnen worden geproduceerd wanneer eiwitten reageren met hydroxylradicalen7. Een dergelijke eenvoudige chemie vergemakkelijkt de identificatie van gelabelde sites.
Hier bieden we protocollen voor het gebruik van OP DEPC gebaseerde CL-MS om eiwitstructuur en interacties te bestuderen. Details in verband met reagensbereiding, DEPC-eiwitreacties, eiwitverteringsomstandigheden, LC-MS- en MS/MS-parameters en gegevensanalyse worden beschreven. We tonen ook het nut van DEPC-etikettering aan door voorbeeldresultaten te geven van eiwit-metaal-, eiwit-ligand- en eiwit-eiwitinteracties, evenals eiwitten die structurele veranderingen ondergaan bij verhitting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen
Er moeten verschillende punten met betrekking tot het experimentele ontwerp worden overwogen om betrouwbare etiketteringsresultaten te garanderen. Ten eerste, om eiwitetikettering te maximaliseren, is het noodzakelijk om buffers met sterk nucleofiele groepen (bijv. Tris) te vermijden, omdat ze kunnen reageren met DEPC en de mate van etikettering kunnen verlagen. Het is ook denkbaar dat dergelijke buffers kunnen reageren met gelabelde residuen, waardoor het etiket wordt verwijderd en dus struc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen steun van de National Institutes of Health (NIH) onder Grant R01 GM075092. De Thermo Orbitrap Fusion massaspectrometer die werd gebruikt om enkele van de hier beschreven gegevens te verkrijgen, werd verworven met fondsen van de National Institutes of Health grant S10OD010645.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
References
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
- Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
- Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
- Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
- Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
- Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
- Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
- Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
- Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
- Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
- Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
- Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
- Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
- Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
- Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
- Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
- Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
- Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
- Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
- Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
- Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
- Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
- Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
- Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O’Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
- Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
- Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
- Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO – A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
- Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).
