Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme
Summary
Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.
Abstract
Bir proteinin yüksek sıralı yapısını karakterize etmek, işlevini anlamak için gereklidir. Kütle spektrometresi (MS), özellikle geleneksel yöntemlerle incelenmesi zor protein sistemleri için bu amaç için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bir proteinin yapısını MS ile incelemek için, bir proteinin yapısal bilgilerini kütlesine kodlayan çözeltide spesifik kimyasal reaksiyonlar gerçekleştirilir. Özellikle etkili bir yaklaşım, solvent erişilebilir amino asit yan zincirlerini kovalent olarak değiştiren reaktifler kullanmaktır. Bu reaksiyonlar, proteolitik sindirim ve tandem kütle spektrometresi ile birleştirildiğinde kalıntı düzeyinde çözünürlükle lokalize edilebilen kütle artışlarına yol açar. Burada, dietilpyrokarbonat (DEPC) kullanımıyla ilişkili protokolleri MS algılaması ile birlikte bir kurdent etiketleme reaktifi olarak açıklıyoruz. DEPC, ortalama proteindeki kalıntıların% 30’una kadar etiketleme yapabilen ve böylece mükemmel yapısal çözünürlük sağlayan son derece elektrofilik bir moleküldür. DEPC, MS ile birlikte β2-mikroglobulin gibi küçük tek etki alanı proteinleri için monoklonal antikorlar gibi büyük çok alanlı proteinlere yapısal bilgi elde etmek için başarıyla kullanılmıştır.
Introduction
Proteinler hemen hemen her fizyolojik süreçte temel biyomoleküllerdir. Proteinlerin gerçekleştirdiği fonksiyonların çeşitliliği, benimsedikleri yapılar ve diğer biyomoleküllerle olan etkileşimleri nedeniyle mümkündür. Protein fonksiyonunu daha derin bir düzeyde anlamak için, bu önemli yapısal özellikleri ve etkileşimleri aydınlatmak için biyokimyasal ve biyofiziksel araçlara ihtiyaç vardır. Geleneksel olarak, X-ışını kristalografisi, kriyojenik elektron mikroskopisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi protein yapısını ortaya çıkarmak için istenen atom seviyesi detayını sağlamıştır. Bununla birlikte, zayıf kristalleşme davranışı, sınırlı protein mevcudiyeti, aşırı numune heterojenliği veya moleküler ağırlık sınırlamaları nedeniyle çok sayıda protein sistemi bu tekniklerle sorgulanamaz. Sonuç olarak, bu sınırlamaların üstesinden gelen daha yeni analiz yöntemleri ortaya çıkmıştır. Protein yapısal bilgilerini sağlayabilecek gelişen teknikler arasında kütle spektrometresi de yer alıyor.
Kütle spektrometresi (MS) bir molekülün kütle-şarj (m/z) oranını ölçtİğİnden, istenen yapısal bilgilerin proteinin kütlesine kodlanarak protein daha yüksek sıralı yapısal bilgiler elde edilmelidir. Bu bilgileri kodlamak için hidrojen-döteryum değişimi (HDX) 1,2 ,3,4,kimyasal çapraz bağlama (XL)5,6ve kurcalama etiketleme (CL) 7 , 8,9,10dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. HDX’te omurga ortası hidrojenler, solvent erişilebilirliğine ve H-bonding kapsamına bağlı oranlarda biraz daha büyük döteryumlarla değiştirilir. HDX’in kapsamı, bu parçaları kütle spektrometresi ile ayırmadan ve ölçmeden önce proteini peptit parçalarına hızla sindirerek veya yukarıdan aşağıya bir deneyde proteini ayırarak lokalize edilebilir. Değişim hızının belirlenmesi protein dinamikleri hakkında daha fazla bilgi sağlar. HDX, geri değişimle ilgili zorluklara ve tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmak için özel ekipman ihtiyacına rağmen protein yapısını karakterize etmek için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. XL-MS’de proteinler, belirli bir protein içindeki veya iki protein arasındaki bitişik kalıntı yan zincirlerini aktif olarak bağlayan iki fonksiyonel reaktiflerle reaksiyona sokulur. Bunu yaparken XL-MS, protein yapısını karakterize etmek için kullanılabilecek mesafe kısıtlamaları sağlayabilir. Proteinin çapraz bağlı bölgeleri proteolitik sindirim ve ardından sıvı kromatografisi (LC)-MS analizi ile tanımlanabilir. XL-MS, iç hücreler de dahil olmak üzere çeşitli protein komplekslerini incelemek için kullanılan çok yönlü bir araç olsa da, XL ürünlerinin tanımlanması zordur ve özel yazılım gerektirir.
CL-MS son zamanlarda protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için tamamlayıcı ve bazen alternatif MS tabanlı bir araç olarak ortaya çıkmıştır. CL-MS’te, bir protein veya protein kompleksi, solvent maruz kalan yan zincirlerle reaksiyona girebilen tek fonksiyonlu bir reaktif ile birlikte değiştirilir (Şekil 1). Bir protein veya protein kompleksinin modifikasyon kapsamları farklı koşullar altında karşılaştırılarak, konformasyon değişiklikleri, bağlama bölgeleri ve protein-protein arayüzleri ortaya çıkabilir. CL reaksiyonu sonrasında, genellikle tek amino-asit düzeyinde, proteinlerin proteolitik olarak sindirildiği, peptit parçalarının LC ile ayrıldığı ve modifiye edilen bölgelerin tandem MS (MS/MS) kullanılarak tanımladığı tipik aşağıdan yukarıya proteomik iş akışları kullanılarak meydana özgü bilgiler elde edilebilir. Biyokonjuge kimyanın zengin tarihi, CL-MS deneyleri için çok sayıda reaktifi kullanıma sunmuştur. CL reaktifleri iki genel kategoriye ayrılır: (i) spesifik ve (ii) spesifik olmayan. Spesifik reaktifler tek bir fonksiyonel grupla (örneğin, serbest aminler)8,10 ile reaksiyona girilir ve uygulanması kolaydır, ancak sınırlı yapısal bilgi sağlama eğilimindedirler. Spesifik olmayan reaktifler çok çeşitli yan zincirlerle reaksiyona girer, ancak genellikle bu yüksek reaktif türleri üretmek için lazerler veya senkrotron kaynakları gibi özel ekipmanlar gerektirir. Hidroksil radikalleri, çeşitli koşullar altında çok çeşitli proteinleri ve protein komplekslerini incelemek için hidroksil radikal ayak izi (HRF)7,11,12,13 deneylerinde uygulanan, en sık kullanılan spesifik olmayan reaktiftir.
Araştırma grubumuz, CL-MS deneyleri14 , 15 , 16 ,17 , 18 , 19,20 , 21 , 22,23,24,25bağlamında protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için dietilpyrokarbonat (DEPC) adı verilen nispeten spesifik olmayan başka bir reaktifibaşarıylakullanmıştır. DEPC, ortalama proteindeki amino asitlerin% 30’una kadar reaksiyona girerken, belirli etiketleme reaktiflerinin basitliğini sunar (yani, reaksiyonları gerçekleştirmek için özel bir ekipman gerekmez). Son derece elektrofilik bir reaktif olarak DEPC, sistein, histidin, lizin, tirozin, serin ve threonine kalıntılarının N-terminus ve nükleofilik yan zincirleri ile reaksiyona girer. Tipik olarak, bu reaksiyonların tek bir ürünü üretilir ve 72.02 Da’lık bir kütle artışına neden edilir. Bu tek ürün türü, proteinler hidroksil radikalleri ile reaksiyona girdiğinde üretilebilen 55 farklı ürünle tezat oluşturur7. Bu tür basit kimya, etiketli sitelerin tanımlanmasını kolaylaştırır.
Burada, protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için DEPC tabanlı CL-MS kullanımına yönelik protokoller sunuyoruz. Reaktif hazırlama, DEPC-protein reaksiyonları, protein sindirim koşulları, LC-MS ve MS/MS parametreleri ve veri analizi ile ilgili ayrıntılar açıklanmıştır. Ayrıca protein-metal, protein-ligand ve protein-protein etkileşimlerinin yanı sıra ısıtma sırasında yapısal değişikliklere uğrayan proteinlerden örnek sonuçlar sağlayarak DEPC etiketlemesinin faydasını gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik Adımlar
Güvenilir etiketleme sonuçları sağlamak için deneysel tasarımla ilgili çeşitli noktalar göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, protein etiketlemeyi en üst düzeye çıkarmak için, depc ile reaksiyona girebilecekleri ve etiketleme kapsamını düşürebilecekleri için güçlü nükleofilik gruplara (örneğin Tris) sahip tamponlardan kaçınmak gerekir. Bu tür tamponların etiketli kalıntılarla reaksiyona neden olabileceği, etiketin çıkarılmasına ve dolayısıyla yap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Grant R01 GM075092 kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (NIH) destek kabul ediyorlar. Burada açıklanan verilerin bir kısmını elde etmek için kullanılan Thermo Orbitrap Fusion kütle spektrometresi, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi S10OD010645’ten alınan fonlarla elde edildi.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
References
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
- Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
- Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
- Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
- Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
- Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
- Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
- Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
- Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
- Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
- Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
- Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
- Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
- Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
- Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
- Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
- Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
- Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
- Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
- Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
- Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
- Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
- Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
- Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O’Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
- Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
- Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
- Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO – A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
- Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).
