Ковалентная маркировка диэтилпирокарбонатом для изучения структуры белка высшего порядка с помощью масс-спектрометрии

Белки являются важными биомолекулами практически в каждом физиологическом процессе. Разнообразие функций, которые выполняют белки, возможно из-за структур, которые они принимают, и взаимодействий, которые они имеют с другими биомолекулами. Чтобы понять функцию белка на более глубоком уровне, необходимы биохимические и биофизические инструменты для выяснения этих важных структурных особенностей и взаимодействий. Традиционно рентгеновская кристаллография, криогенная электронная микроскопия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) обеспечивали желаемую детализацию на атомном уровне для выявления структуры белка. Однако многочисленные белковые системы не могут быть опрошены этими методами из-за плохого поведения кристаллизации, ограниченной доступности белка, чрезмерной гетерогенности образца или ограничений молекулярной массы. Следовательно, появились новые методы анализа, которые преодолевают эти ограничения. Среди новых методов, которые могут предоставить структурную информацию белка, является масс-спектрометрия.

Масс-спектрометрия (MS) измеряет отношение массы к заряду молекулы (m/z), поэтому структурная информация белка более высокого порядка должна быть получена путем кодирования желаемой структурной информации в массу белка. Было разработано несколько подходов к кодированию этой информации, включая водородно-дейтериевый обмен (HDX)^1,2,3,4,химическое сшивание (XL)^5,6и ковалентную маркировку (CL)^7,8,9,10. В HDX магистральные амидные водороды обмениваются немного более массивными дейтериями со скоростью, которая зависит от доступности растворителей и степени H-связи. Степень HDX может быть локализована путем быстрого переваривания белка в пептидные фрагменты перед разделением и измерением этих фрагментов масс-спектрометром или путем диссоциации белка в эксперименте сверху вниз. Определение обменного курса дает дальнейшее понимание динамики белка. HDX оказался ценным инструментом для характеристики структуры белка, несмотря на проблемы, связанные с обратным обменом и необходимостью специализированного оборудования для максимизации воспроизводимости. В XL-MS белки реагируют с бифункциональными реагентами, которые ковалентно связывают соседние боковые цепи остатка внутри данного белка или между двумя белками. При этом XL-MS может обеспечить ограничения расстояния, которые могут быть использованы для характеристики структуры белка. Области белка, которые являются сшитыми, могут быть идентифицированы с помощью протеолитического пищеварения с последующим анализом жидкостной хроматографии (LC)-MS. В то время как XL-MS является универсальным инструментом, который использовался для изучения различных белковых комплексов, в том числе внутри клеток, идентификация продуктов XL является сложной задачей и требует специализированного программного обеспечения.

CL-MS появился в последнее время как дополнительный, а иногда и альтернативный инструмент на основе MS для изучения структуры и взаимодействий белка. В CL-MS белок или белковый комплекс ковалентно модифицируют монофункциональным реагентом, который может реагировать с боковыми цепями, подвергающимися воздействию растворителя(рисунок 1). Сравнивая степени модификации белка или белкового комплекса в различных условиях, можно выявить конформационные изменения, сайты связывания и белково-белковые интерфейсы. После реакции CL сайт-специфическая информация, часто на уровне одной аминокислоты, может быть получена с использованием типичных рабочих процессов протеомики снизу вверх, в которых белки протеолитически перевариваются, пептидные фрагменты разделяются LC, а модифицированные участки идентифицируются с использованием тандема MS (MS / MS). Богатая история химии биоконъюгатов сделала многочисленные реагенты доступными для экспериментов CL-MS. Реагенты CL делятся на две общие категории: (i) специфические и (ii) неспецифические. Специфические реагенты реагируют с одной функциональной группой (например, свободными аминами)^8,10 и легко реализуются, но они, как правило, предоставляют ограниченную структурную информацию. Неспецифические реагенты реагируют с широким спектром боковых цепей, но часто требуют специализированного оборудования, такого как лазеры или синхротронные источники для получения этих высокореактивных видов. Гидроксильные радикалы являются наиболее часто используемым неспецифическим реагентом, поскольку были применены в гидроксильных радикалах (HRF)^7,11,12,13 экспериментов для изучения широкого спектра белков и белковых комплексов в различных условиях.

Наша исследовательская группа успешно использовала другой относительно неспецифический реагент под названием диэтилпирокарбонат (DEPC) для изучения структуры и взаимодействий белка в контексте экспериментов CL-MS^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.} DEPC предлагает простоту специфических реагентов маркировки (т.е. для выполнения реакций не требуется специализированное оборудование), реагируя при этом с 30% аминокислот в среднем белке. Как высокоэлектрофильный реагент, DEPC способен реагировать с N-концем и нуклеофильными боковыми цепями цистеина, гистидина, лизина, тирозина, серина и остатков треонина. Как правило, образуется один продукт этих реакций, в результате чего увеличивается масса на 72,02 Да. Этот единственный тип продукта контрастирует с 55 различными продуктами, которые могут быть получены, когда белки реагируют с гидроксильными радикалами^7. Такая простая химия облегчает идентификацию маркированных участков.

Здесь мы предоставляем протоколы для использования CL-MS на основе DEPC для изучения структуры и взаимодействий белка. Описаны детали, связанные с препаратом реагента, реакциями DEPC-белка, условиями переваривания белка, параметрами LC-MS и MS/MS, а также анализом данных. Мы также демонстрируем полезность маркировки DEPC, приводя примеры результатов взаимодействия белка-металла, белка-лиганда и белка-белка, а также белков, претерпевающих структурные изменения при нагревании.