OrganoCat Prosesi kullanılarak Lignoselülozik Biyokütlenin Fraksiyonasyonu

NOT: Numuneler oda sıcaklığında (birkaç gün) veya buzdolabında (daha uzun süreler için) bırakılarak işlem herhangi bir noktada duraklatılabilir. Bu protokolde kullanılan malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu’na bakın. 1. Kayın ağacı parçacıkları 10 mm elekli bir kesme değirmeni kullanarak kayın ahşiminin(Fagus sp.) istenen parçacık boyutunu oluşturun ve parçacıkları 50 °C’de sabit kütleye (~24 saat) kurutun ve ~ su kalıntısı nem içeriği bırakın. 2. Lignoselülozik fraksiyonasyon ve çalışma Lignoselüloz ön işlem ve fraksiyonasyonu 25 mL paslanmaz çelik yüksek basınçlı reaktörde oda sıcaklığında 5 mL ultra saf suda 500 mg kayın ağacı(Fagus sp.) partikülleri ve 78,0 mg (0,5 mmol, 0,1 M) FDCA’yı askıya alın. Süspansiyona 5 mL 2-MTHF ve karıştırma çubuğu ekleyin ve reaktörü kapatın. Reaktörü 1 saat boyunca 1500 rpm karıştırma hızında bir ısıtma plakasında 160 °C’ye ısıtın. Reaksiyonun ~ 10 dakikalık bir süre boyunca buzlu suda oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Reaktörü açın, 52,5 μL NaOH çözeltisi ekleyin (damıtılmış suda% 50 NaOH) ve oda sıcaklığında 15 dakika ve karıştırma plakasında 500 rpm karıştırın. Organik faz ve lignin nicelliğinin izolasyonu Karışımı santrifüjleyin (oda sıcaklığı, 5 dk, 1880 × g). Organik fazı (2-MTHF) 50 mL yuvarlak tabanlı bir şişeye aktarmak için bir pipet kullanın. Organik fazı bir döner evaporatörde (40 °C, 200 rpm, 180 mbar) katı ve kuru bir lignin fraksiyonu elde edilene kadar buharlaştırın. Analitik bir terazi ile tartarak lignin verimini belirleyin. Daha fazla analiz için katı lignin’i oda sıcaklığında saklayın. Katı selülozla zenginleştirilmiş hamurun ve sulu fazın ayrılması Selülozla zenginleştirilmiş hamuru izole etmek için bir hunide selüloz filtre kağıdı (17-30 μm gözenek boyutu) kullanarak sulu fazı filtreleyin ve sulu fazı 5 mL şişeye aktarın. Hamuru nötr pH’a kadar 3 x 25 mL su ile yıkayın ve yıkama çözeltisini ayrı ayrı 100 mL’lik bir beherde saklayın. Hamuru 80 °C’de sabit kütleye (~24 saat) kurutun. Analitik bir terazi ile tartarak kurutulmuş hamur verimini belirleyin. FDCA geri kazanımı ve sulu fazın izolasyonu Sulu fazın pH’ını ve yıkama solüsyonunun pH’ını, çözeltiyi bir buz banyosunda soğutarken konsantre HCl kullanarak sürekli karıştırma altında ayrı ayrı 2.3 adımdan pH 1’e ayarlayın. Evrensel gösterge kağıdı kullanarak pH’ı kontrol edin. Çökemiş katıyı (FDCA) her iki çözeltiden de filtreleyin, kalıntıları birleştirin ve 80 °C’de sabit kütleye (~24 saat) kurutun. Yıkamaları atın. Analitik terazi ile tartarak FDCA verimini belirleyin. Sulu fazı 25 mL şişeye aktarın ve analiz için 4 °C’de saklayın. Furfural niceleme için numune hazırlama Furfural miktarını belirlemek için ayrı bir deneme gerçekleştirin. 2.1.1-2.2.1 adımlarını yineleyin. Toplanan organik çözücü fraksiyona dahili standart olarak 40 mg n-decane ekleyin ve analiz için saklayın. 3. Analiz Atımlı amperometrik algılama ile yüksek performanslı anion-değişim kromatografisi ile sulu fazdaki şekerin analizi (HPAEC-PAD) 2.4.3 adımda toplanan sulu fazın 10 μL’sini 190 μL damıtılmış su ile seyreltin. Seyreltilmiş örneğe 10 μL 2 mM 2-deoksi-D-glikoz ekleyin. Monoakkaritlerin ayrılmasını 0,5 mL-1 akış hızına sahip bir monoakkarit ayırıcı kolona gerçekleştirin ve equilibration’dan sonra numuneyi10dakika boyunca 2 mM NaOH ile enjekte edin. Nötr şekerleri 18 dakika boyunca 2 mM NaOH ile ayırın. Daha sonra, üronik asitleri ayırmak için 10 dakika boyunca 550 mM NaOH kullanın. Sütunu 800 mM NaOH ile 10 dakika durulayın.NOT: Yazılım, monoakkarit miktarlarını iç standart miktarına normalleştirir ve farklı monoakkaritlerin standart kalibrasyon eğrilerini kullanarak bunları ölçendir. 1H-13C heteronükleer tek kuantum korelasyon nükleer manyetik rezonans yoluyla lignin analizi (1H-13C-HSQC NMR) 0,5 mL’lik döterlenmiş dimetilsüllfoksitte ([d 6 ] DMSO)~50mg lignin çözün ve karışımı bir NMR tüpüne aktarın. 400MHz spektrometre kullanarak 1 H-13C HSQC (ölçüm süresi 220 dk) NMR ölçümleri yapın. Spektrumu kullanarak lignin içinde bulunan bağlantı türlerini belirleyin. Spektrumun kimyasal kaymasına DMSO sinyaline (δ (1H) = 2.500 ppm; δ(13C) = 39.52 ppm) referans. Tüm sinyaller pozitif olana kadar her iki eksende de manuel faz düzeltmesi gerçekleştirin, ardından temel düzeltme gerçekleştirin. Aromatik birimlerin sinyallerini ve lignin bağlantılarını entegre edin; kimyasal kaymalar için Tablo 1’e bakın. Aşağıdaki formülü kullanarak aromatik birimlerin toplamını (arom.) hesaplayın:Φ(arom.) = (S2,6 / 2) + ((G2 + G5) / 2) + (H2,6 / 2) (1)Si’nin 2 ve 6 şırıngil protonlarına karşılık gelen sinyalin ayrılmaz parçası olması, Gi’nin 2 ve 5 guaiacyl protonlarına karşılık gelen sinyallerin üzerindeki integral olması ve Hi’nin 2 ve 6 p-hidroksifenil protonlara karşılık gelen sinyalin ayrılmaz parçası olmasıyla. Aşağıdaki formülleri kullanarak her birimin yüzdesini hesaplayın:S = (S2,6/ 2) / Φ(arom.) × 100% (2)G = ((G2 + G5) / 2) / Φ(arom.) × 0 (3)H = (H2,6 / 2) / Φ(arom.) × 100% (4)S, G ve H ile ilgili monomerlerin yüzdeleri-şırıngil- (S), guaiacyl- (G) ve p-hidroksifenil (H)-monomer ünite başına 100 monomer ünite. Aşağıdaki formülleri kullanarak 100 birim başına bağlantı sayısını hesaplayın:β-O-4 linkleri = α β-O-4 / Φ(arom.) × 0 (5)linkajlar = (α β-β + β β-β + γ β-β) / Φ(arom.) × 0 (6)linkajlar = (α β-5 + β β-5 + γ β-5) / Φ(arom.) × 0 (7)α, β ve γ, karşılık gelen β-O-4-, β-β- ve β-5 bağlantılarının α, β ve γ-proton sinyallerine karşılık gelen sinyal üzerindeki integraldir.NOT: Bağlantı, 100 monomer ünite başına bağlantı olarak verilir. Zirvelerin üst üste binmesi nedeniyle,β-O-4 yalnızca α proton sinyali kullanılarak hesaplanır. β-β ve β-5 bağlantı, ilgili bağlantının tüm sinyalleri kullanılarak hesaplanır. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) analizi 10 mg kurutulmuş lignin ve 1 mg glikozu (iç standart olarak) 0,1 M NaOH’un 1 mL’sinde ve 1,5 mL gaz kromatografisinde(GC)- şişede % 0,01 wt NaN 3 sulu çözeltide çözün. GC şişesini septumlu bir kapak kullanarak kapatın. Numunenin 100 μL’lik kısmını ultraviyole dedektörü ile donatılmış ve φ = 280 nm dalga boyını izleyen yüksek performanslı bir sıvı kromatografi (HPLC) sistemine enjekte edin. Polar silika (8 mm x 50 mm) ve üç jel sütun (8 mm x 300 mm, parçacık çapı: 5 μm, nominal gözenek genişliği: 1000 Å) ile 1 mL min-1akış hızında önkol programlanmış sıcaklık bölünmüş /bölünmemiş enjektör sisteminden oluşan bir sistem kullanın. Elde edilen verileri iç standardın (glikoz) sinyaline referans verin. 266 ila 65000 Da arasında poli (stiren sülfonat) ile harici bir kalibrasyona atıfta bulunulan yazılımı kullanarak kütle dağılımını hesaplayın. GC ile furfural niceleme OrganoCat ön işlem organik fazı için iç standart olarak 20 mg n-decane ekleyin. Organik fazın 1 mL’lik kısmını 1,5 mL GC şişesine aktarın. Bu çözeltinin 1 μL’lik kısmını, polar poliüretan glikol sabit fazlı 30 m’lik bir sütun ve 1,5 mL dk-1 debiye ve alev iyonlaştırma dedektörüne sahip taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak bir gaz kromatografına enjekte edin. Başlangıç sıcaklığını 50 °C’ye ayarlayın, ardından 8 °C veya-1 ila 250 °C yükseltin ve 5 dakika boyunca 250 °C’de koruyun. Yazılım tarafından verilen integralleri (Int) ve harici olarak hesaplanan bir düzeltme faktörünü (cf) kullanarak furfural’ı ölçün. 1 mg furfural ve 5 mg n-decane’den oluşan bir numuneyi 1 mL 2-MTHF’de hazırlayın ve yukarıda belirtilen prosedürü kullanarak GC’ye enjekte edin. Düzeltme faktörünü aşağıdaki gibi hesaplayın:cf = (Int(n-decane) / m (n-decane)) / (Int(furfural) / Int(furfural)) (8) Bilinmeyen örnekteki furfural miktarını aşağıdaki formülle hesaplamak için düzeltme faktörünü kullanın:m(furfural) = m (n-decane) / Int (n-decane) × cf × Int(furfural) (9) Selülozla zenginleştirilmiş pulpa hidrolizi OrganoCat ön işlemden elde edilen selüloz zenginleştirilmiş kalıntının pulpa hidrolizini 1,5 mL şişe kullanarak karıştırma ile bir ısıtma bloğunda (Malzeme Tablosunabakınız) gerçekleştirin. 1,5 mL’lik şişeye 1 mL sitrat tampona (pH = 4,5)20 mg selüloz zenginleştirilmiş posa ve10μL selüloz (60 filtre kağıdı birimi (FPU) mL -1 ve 82 cellobiase ünitesi (CBU) mL -1) ekleyin, ve 0 saat, 1 saat veya 72 saat boyunca 50 °C’de çalkalayın. Daha sonra, enzimleri denatüre etmek için numuneleri 10 dakika boyunca 99 ° C’ye ısıtın. Glikoz (heksiknaz) test kiti kullanarak glikoz konsantrasyonu belirleyin.