有機Catプロセスを用いたリグノセルロース系バイオマスの分画

注:プロセスは、室温(数日間)または冷蔵庫(より長い期間)にサンプルを残すことによって、任意の時点で一時停止することができます。このプロトコルで使用される材料の詳細については、 資料表 を参照してください。 1. ブナ材の粒子 ブナ材の粒子径(Fagus sp.)を10mmふるいの切削ミルを用いて生成し、50°Cで粒子を一定の質量(〜24時間)に乾燥させ、残った水分含有量を10%程度残します。 2. リグノセルロース分画とワークアップ リグノセルロース前処理と分画 ブナ材500mg(Fagussp)粒子と78.0mgのFDCAの78.0mg(0.5 mmol,0.1 M)を、25mLのステンレス鋼高圧反応器で室温で超純水5mLで懸濁します。懸濁液に5mLの2-MTHFと攪拌バーを加え、反応器を閉じます。1時間1500rpmの攪拌速度で加熱プレート上で160°Cに反応器を加熱します。 10分の間、氷水中の反応を室温まで冷まします。反応器を開き、NaOH溶液52.5μL(蒸留水に50重量%NaOH)を加え、攪拌板で室温で15分間、500rpmで攪拌します。 有機相の分離とリグニン定量 混合物を遠心分離する(室温、5分、1880×g)。 ピペットを使用して、有機相(2-MTHF)を50 mLのラウンドボトムフラスコに移します。 有機相をロータリーエバポレーター(40°C、200rpm、180mbar)で蒸発させ、固体および乾燥リグニン分画が得られるまで。分析バランスで計量することでリグニンの収率を決定します。固体リグニンを室温で保存し、さらに分析します。 固体セルロース濃縮パルプと水相の分離 セルロースフィルターペーパー(17~30μmの孔径)を使用してセルロースを濃縮したパルプを分離し、水相を5mLバイアルに移します。パルプを3 x 25 mLの水で中性pHまで洗浄し、100 mLビーカーに別々に保管してください。パルプを80°Cで一定の質量(〜24時間)に乾燥させます。 分析バランスで計量することにより、乾燥パルプ収率を決定します。 水相のFDCAリカバリと分離 氷浴中の溶液を冷却しながら濃縮されたHClを用いて、一定撹拌下でステップ2.3から水相及び洗浄液のpHをpH1に調整する。ユニバーサルインジケーター用紙を使用してpHを制御します。 両方の溶液から沈殿した固体(FDCA)を濾過し、残基を組み合わせ、80°Cで一定の質量(〜24時間)に乾燥させた。するは捨てよ。分析バランスで計量することでFDCAの収率を測定します。 水相を25mLフラスコに移し、4°Cで保存して分析します。 フルフラール定量のサンプル調製 別の実験を実行して、フルフラールの数量を決定します。ステップ 2.1.1 から 2.2.1 を繰り返します。 収集した有機溶媒画分に内部標準として 40mgのn-デカンを加え、分析用に保存します。 3. 分析 パルスアンペロメトリック検出(HPAEC-PAD)による高性能アニオン交換クロマトグラフィーによる水相の糖の分析 190 μLの蒸留水でステップ2.4.3で集めた水相の10μLを希釈します。希釈したサンプルに2 mM 2-デオキシDグルコースの10 μLを加えます。 流量0.5 mL∙min-1の単糖セパレータカラムで単糖類の分離を行い、2mM NaOHで平衡後10分間サンプルを注入します。中性糖を2 mM NaOHで18分以上分離します。その後、550 mM NaOH を 10 分間使用して、ウロン酸を分離します。800 mM NaOH でカラムを 10 分間リンスします。注:ソフトウェアは、単糖の量を内部標準の量に正規化し、異なる単糖の標準キャリブレーション曲線を使用して定量化します。 1H-13Cヘテロ核単一量子相関核磁気共鳴によるリグニン解析(1H-13C-HSQC NMR) 0.5mLの重水素ジメチルスルホキシド([d 6]DMSO)にリグニンの50mgを溶解し、混合物をNMRチューブに移します。400 MHz の分光計を使用して、1H-13C HSQC (測定時間 220 分) NMR 測定を行います。 スペクトルを使用してリグニンに存在するリンケージの種類を決定する。 DMSO信号へのスペクトルの化学シフトを参照してください(δ(1H) = 2.500 ppm; δ(13 C) = 39.52 ppm. すべての信号が正になるまで両軸で手動の位相補正を行い、ベースライン補正を実行します。 芳香族ユニットの信号とリグニンのリンケージを統合します。化学シフトについては 、表1 を参照してください。 次の式を使用して、芳香族単位 (arom.) の合計を計算します。Σ(arom.) = (S2,6 / 2) + ((G2 + G5) / 2) + (H2,6 / 2) (1)Si は、2および6シリンギル陽子に対応する信号の上に積分され、Gi は2および5グアヤシル陽子に対応する信号の上に積分であり、Hi は2および6 p-ヒドロキシフェニル陽子に対応する信号の上に積分である。 次の式を使用して、各単位の割合を計算します。S = (S2,6/ 2) / Σ(arom.) × 100% (2)G =(G2 + G5) / 2) / Σ(arom.) × 100% (3)H = (H2,6 / 2) / Σ(arom.) × 100% (4)S、G、およびHが各モノマー-シリンギル−(S)の割合であるとともに、グアイアシル−(G)、 およびp−ヒドロキシフェニル(H)−モノマー単位当たり100単位当たり。 次の式を使用して、100 単位あたりのリンケージ数を計算します。β-O-4 リンケージ = α β-O-4 / Σ (arom.) × 100% (5)リンケージ = (α β-β + β β-β + γ β β) / Σ(arom.) × 100% (6)リンケージ = (α β-5 + β β-5 + γ β-5) / Σ(arom.) × 100% (7)α、β、γが、対応するβ-O-4-、β-β、β-5リンケージのα、β、γ-陽子信号に対応する信号に対して積分される。注:リンケージは、100モノマー単位あたりのリンケージとして与えられます。ピークの重なり合いにより、β-O-4はαプロトン信号のみを用いて計算される。β-βおよびβ-5リンケージは、対応するリンケージのすべてのシグナルを使用して計算されます。 ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)解析 乾燥リグニン10mgとグルコース1mg(内部標準)を0.1M NaOHの1mL、1.5mLガスクロマトグラフィー(GC)バイアルで0.01重量%NaN3水溶液に溶解します。中隔のキャップを使用してGCバイアルを閉じます。 100 μL のサンプルを、紫外線検出器を搭載した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムに注入し、λ = 280 nm の波長をモニタリングします。極性シリカ(8 mm x 50 mm)と3つのゲルカラム(8 mm x 300 mm、粒子径:5 μm、公称孔幅:1000 Å)を備えた事前段組みプログラム温度スプリット/スプリットレスインジェクターシステムで構成されるシステムを、1 mL min-1の流量で使用します。得られたデータを内部標準の信号(グルコース)に参照する。266~65000 Daの範囲でポリ(スチレンスルホン酸)を用いた外部較正を参照し、ソフトウェアを使用して質量分布を計算します。 GC によるフルフラール定量化 OrganoCat前処理の有機相に内部標準として20mg n-デカンを加えます。有機相1mLを1.5mLのGCバイアルに移します。 この溶液の1 μLを、1.5 mLminの流量を有するキャリアガスとして極性ポリウレタングリコール定常相とヘリウムを用いた30mカラムを用いてガスクロマトグラフに注入し、炎イオン化検出器を使用します。初期温度を50°Cに設定し、8°C-1~250°Cで昇温し、250°Cで5分間維持します。 ソフトウェアによって与えられた積分(Int)と外部計算された補正係数(cf)を使用して、フルフラールを定量化します。 2-MTHFの1mLに1mgのフルフラールと5mgの n-デカンのサンプルを調製し、前述の手順を用いてGCに注入する。補正係数を次のように計算します。cf = (Int(n -デケイン)/m(n -デケイン)) / (Int(フルフラール)/Int(フルフラール)) (8) 次の数式を使用して、未知のサンプルのフルフラルの量を計算するには、補正係数を使用します。m(フルフラール) =m(n-デカン) / イント(n-デカン) × cf × Int(フルフラール) (9) セルロース濃縮パルプ加水分解 1.5 mLバイアルを用いて、加熱ブロックでオルガノキャット前処理から得られたセルロース濃縮残渣のパルプ加水分解を行う( 材料表参照)。 セルロースを豊富に含むパルプ20mgとセルラーゼ10μL(60濾紙単位(FPU)mLおよび82セロビアス単位(CBU)mL-1)を1.5mLバイアルで1mL(pH = 4.5)に加え、50°Cで0h、1h、または72hで振る。その後、サンプルを99°Cに加熱して10分間加熱し、酵素を変性させます。 グルコース(ヘキソキナーゼ)アッセイキットを用いてグルコース濃度を決定する。