Fractionering van lignocellulosische biomassa met behulp van het OrganoCat-proces

OPMERKING: Het proces kan op elk moment worden gepauzeerd door de monsters op kamertemperatuur (gedurende een paar dagen) of in de koelkast (voor langere periodes) te laten. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de materialen die in dit protocol worden gebruikt. 1. Beukenhoutdeeltjes Genereer de gewenste deeltjesgrootte van beukenhout(Fagus sp.) met behulp van een snijmolen met een zeef van 10 mm en droog de deeltjes bij 50 °C tot een constante massa (~ 24 uur), waardoor een restvochtgehalte van ~ 10% water overblijft. 2. Lignocellulosische fractionering en workup Lignocellulose voorbehandeling en fractionering Suspensie van 500 mg beukenhout(Fagus sp.)deeltjes en 78,0 mg (0,5 mmol, 0,1 M) FDCA in 5 ml ultrapruimend water bij kamertemperatuur in een roestvrijstalen hogedrukreactor van 25 ml. Voeg 5 ml 2-MTHF en een roerstaaf toe aan de suspensie en sluit de reactor. Verwarm de reactor tot 160 °C op een verwarmingsplaat met een roersnelheid van 1500 tpm gedurende 1 uur. Laat de reactie afkoelen tot kamertemperatuur in ijswater gedurende een periode van ~10 min. Open de reactor, voeg 52,5 μL NaOH-oplossing (50 wt% NaOH in gedestilleerd water) toe en roer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en 500 tpm op een roerplaat. Isolatie van organische fase en lignine kwantificering Centrifugeer het mengsel (kamertemperatuur, 5 min, 1880 × g). Gebruik een pipet om de organische fase (2-MTHF) over te brengen naar een kolf met ronde bodem van 50 ml. Verdamp de organische fase in een roterende verdamper (40 °C, 200 tpm, 180 mbar) totdat een vaste en droge ligninefractie is verkregen. Bepaal de lignineopbrengst door te wegen met een analytische balans. Bewaar de vaste lignine bij kamertemperatuur voor verdere analyse. Scheiding van vaste cellulose-verrijkte pulp en waterige fase Filtreer de waterige fase met behulp van een cellulosefilterpapier (poriegrootte van 17-30 μm) in een trechter om de met cellulose verrijkte pulp te isoleren en breng de waterige fase over naar een injectieflacon van 5 ml. Was de pulp tot een neutrale pH met 3 x 25 ml water en bewaar de wasoplossing apart in een bekerglas van 100 ml. Droog de pulp bij 80 °C tot een constante massa (~24 uur). Bepaal de opbrengst van de gedroogde pulp door te wegen met een analytische balans. FDCA-herstel en isolatie van waterige fase Pas de pH van de waterige fase en de wasoplossing van stap 2.3 onder constant roeren afzonderlijk aan op pH 1 met geconcentreerd HCl terwijl de oplossing in een ijsbad wordt afgekoeld. Regel de pH met universeel indicatorpapier. Filtreer de neergeslagen vaste stof (FDCA) uit beide oplossingen, combineer de residuen en droog bij 80 °C tot een constante massa (~ 24 uur). Gooi de wasbeurten weg. Bepaal de FDCA-opbrengst door te wegen met een analytische balans. Breng de waterige fase over in een kolf van 25 ml en bewaar deze bij 4 °C voor analyse. Monstervoorbereiding voor furfurale kwantificering Voer een afzonderlijk experiment uit om de hoeveelheid furfural te bepalen. Herhaal stap 2.1.1-2.2.1. Voeg 40 mg n-decane als interne standaard toe aan de verzamelde organische oplosmiddelfractie en bewaar voor analyse. 3. Analyse Analyse van suiker in de waterige fase door middel van hoogwaardige anionenwisselingschromatografie met gepulste amperometrische detectie (HPAEC-PAD) Verdun 10 μL van de waterige fase verzameld in stap 2.4.3 met 190 μL gedestilleerd water. Voeg 10 μL 2 mM 2-deoxy-D-glucose toe aan het verdunde monster. Voer de scheiding van monosacchariden uit op een monosacharidescheidingskolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml ∙ min-1en injecteer het monster na equilibratie met 2 mM NaOH gedurende 10 minuten. Scheid de neutrale suikers met 2 mM NaOH over 18 min. Gebruik daarna 550 mM NaOH gedurende 10 minuten om de uronzuren te scheiden. Spoel de kolom met 800 mM NaOH gedurende 10 min.OPMERKING: De software normaliseert de hoeveelheden monosachariden tot de hoeveelheid van de interne standaard en kwantificeert ze met behulp van standaard kalibratiecurven van de verschillende monosachariden. Lignine analyse via 1H-13C heteronucleaire enkelvoudige kwantumcorrelatie nucleaire magnetische resonantie (1H-13C-HSQC NMR) Los ~50 mg lignine op in 0,5 ml gedeutereerd dimethylsulfoxide ([d6]DMSO) en breng het mengsel over in een NMR-buis. Voer 1H-13C HSQC (meettijd 220 min) NMR-metingen uit met behulp van een 400 MHz spectrometer. Bepaal de soorten verbindingen die aanwezig zijn in de lignine met behulp van het spectrum. Verwijs naar de chemische verschuiving van het spectrum naar het DMSO-signaal (δ(1H) = 2.500 ppm; δ(13C) = 39.52 ppm). Voer een handmatige fasecorrectie uit op beide assen totdat alle signalen positief zijn en voer vervolgens een basislijncorrectie uit. Integreer de signalen van de aromatische eenheden en de koppelingen van de lignine; zie tabel 1 voor de chemische verschuivingen. Bereken de som van de aromatische eenheden (arom.) met behulp van de volgende formule:Σ(arom.) = (S2,6 / 2) + ((G2 + G5) / 2) + (H2,6 / 2) (1)Waarbij Si de integraal is over het signaal dat overeenkomt met de 2 en 6 syringylprotonen, Gi de integralen over de signalen die overeenkomen met de 2 en 5 guaiacylprotonen, en Hi de integraal over het signaal dat overeenkomt met de 2 en 6 p-hydroxyfenylprotonen. Bereken het percentage van elke eenheid met behulp van de volgende formules:S = (S2,6/ 2) / Σ(arom.) × 100% (2)G = ((G2 + G5) / 2) / Σ(arom.) × 100% (3)H = (H2,6 / 2) / Σ(arom.) × 100% (4)Waarbij S, G en H de percentages zijn van respectievelijke monomeren-syringyl- (S), guaiacyl- (G) en p-hydroxyfenyl (H)-monomeereenheden per 100 monomeereenheden. Bereken het aantal koppelingen per 100 eenheden met behulp van de volgende formules:β-O-4 koppelingen = α β-O-4 / Σ(arom.) × 100% (5)koppelingen = (α β-β + β β-β + γ β-β) / Σ(arom.) × 100% (6)koppelingen = (α β-5 + β β-5 + γ β-5) / Σ(arom.) × 100% (7)Waarbij α, β en γ de integraal zijn over het signaal dat overeenkomt met de α-, β- en γ-protonsignalen van de overeenkomstige β-O-4-, β-β- en β-5-koppelingen.OPMERKING: Koppelingen worden gegeven als koppeling per 100 monomeereenheden. Vanwege overlapping van pieken wordt β-O-4 berekend met alleen het α protonsignaal. β-β- en β-5-koppelingen worden berekend met behulp van alle signalen van de overeenkomstige koppeling. Gelpermeatie chromatografie (GPC) analyse Los 10 mg gedroogde lignine en 1 mg glucose (als interne standaard) op in 1 ml van een 0,1 M NaOH en 0,01 wt% NaN3 waterige oplossing in een gaschromatografie (GC)-injectieflacon van 1,5 ml. Sluit de GC-injectieflacon met een dop met septum. Injecteer 100 μL van het monster in een high-performance vloeistofchromatografiesysteem (HPLC) dat is uitgerust met een ultraviolette detector en een golflengte van λ = 280 nm bewaakt. Gebruik een systeem dat bestaat uit een voorgekookt geprogrammeerd temperatuur split/splitless injectorsysteem met polair silica (8 mm x 50 mm) en drie gelkolommen (8 mm x 300 mm, deeltjesdiameter: 5 μm, nominale poriebreedte: 1000 Å) bij een debiet van 1 ml min-1. Verwijs de verkregen gegevens naar het signaal van de interne standaard (glucose). Bereken de massaverdeling met behulp van de software, waarnaar wordt verwezen naar een externe kalibratie met poly(styreensulfonaat) in een bereik van 266 tot 65000 Da. Furfurale kwantificering via GC Voeg 20 mg n-decane als interne standaard toe aan de organische fase van de OrganoCat-voorbehandeling. Breng 1 ml van de organische fase over in een GC-injectieflacon van 1,5 ml. Injecteer 1 μL van deze oplossing in een gaschromatograaf met behulp van een kolom van 30 m met een polaire polyurethaanglycol stationaire fase en helium als dragergas met een stroomsnelheid van 1,5 ml min-1 en een vlamionisatiedetector. Stel de begintemperatuur in op 50 °C, verhoog vervolgens met 8 °C min-1 tot 250 °C en houd gedurende 5 minuten aan op 250 °C. Kwantificeer furfural met behulp van de integralen (Int) die door de software worden gegeven en een extern berekende correctiefactor (cf). Bereid een monster van 1 mg furfural en 5 mg n-decane in 1 ml 2-MTHF en injecteer het in de GC met behulp van de bovengenoemde procedure. Bereken de correctiefactor als volgt:cf = (Int(n-decane) / m(n-decane)) / (Int(furfural) / Int(furfural)) (8) Gebruik de correctiefactor om de hoeveelheid furfural in het onbekende monster te berekenen met de volgende formule:m(furfural) = m(n-decane) / Int(n-decane) × cf × Int(furfural) (9) Cellulose-verrijkte pulp hydrolyse Voer pulphydrolyse uit van met cellulose verrijkt residu verkregen uit OrganoCat-voorbehandeling in een verwarmingsblok met mengen (zie de tabel met materialen)met behulp van injectieflacons van 1,5 ml. Voeg 20 mg met cellulose verrijkte pulp en 10 μL cellulase (60 filterpapiereenheden (FPU) ml-1 en 82 cellobiase-eenheden (CBU) ml-1) toe aan 1 ml citraatbuffer (pH = 4,5) in een injectieflacon van 1,5 ml en schud bij 50 °C gedurende 0 uur, 1 uur of 72 uur. Verwarm daarna de monsters gedurende 10 minuten tot 99 °C om de enzymen te denatureren. Bepaal de glucoseconcentratie met behulp van een glucose (hexokinase) testkit.