Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Las enfermedades transmitidas por vectores son una de las principales amenazas para la salud pública en la evolución constante. Cientos de especies vectoriales repartidas entre familias filogengénicas muy distintas (por ejemplo, mosquitos, garrapatas, pulgas) son responsables de la transmisión de un gran número de patógenos microbianos, lo que resulta en más de 700.000 muertes humanas al año, según la Organización Mundial de la Salud. Entre los insectos vectoriales, las moscas de arena de fenbotomina (Diptera, Psicodidae) constituyen un vasto grupo, con 80 especies vectoriales probadas que exhiben rasgos fenotípicos distintos y capacidades vectoriales que se encuentran en diferentes regiones geográficas. Son vectores para los parásitos protozoicos del género Leishmania,causando alrededor de 1,3 millones de nuevos casos de Leishmaniases y entre 20.000 y 30.000 muertes al año. Los resultados clínicos de leishmaniases son diversos, con síntomas que van desde lesiones cutáneas autolimitantes hasta difusión visceral que es fatal en ausencia de tratamiento.

Las moscas de arena son insectos estrictamente terrestres. Su ciclo de vida, relativamente largo en comparación con otros Diptera, dura hasta tres meses, dependiendo de diferentes parámetros como la temperatura, la humedad y la nutrición. Consta de una etapa embrionaria (6 a 11 días), cuatro etapas larvarias (con una duración total de 23 a 25 días) y una etapa pupal (9 a 10 días) seguida de metamorfosis y luego la edad adulta. Las moscas de la arena requieren un ambiente húmedo y cálido para la cría. Tanto los machos como las hembras se alimentan de azúcares, obtenidos en la naturaleza a partir de néctares de flores. Sólo las hembras son alimentadoras de sangre, ya que requieren proteínas obtenidas de la harina de sangre para la producción de huevos^1.

Un enfoque importante de la investigación es identificar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos que conducen al desarrollo de infecciones transmisibles. Al igual que con otros insectos vectoriales, se ha demostrado que los parámetros intrínsecos a las moscas de arena afectan su competencia vectorial, que se define como su capacidad para transportar y transmitir patógenos a sus huéspedes. Por ejemplo, la expresión de galectinas por el Phlebotomus papatasi sand fly midgut cells, actuando como receptores que reconocen componentes de la superficie del parásito, puede influir directamente en su competencia vectorial para Leishmania major^2,3. La vía de respuesta inmune de insectos, Inmunodeficiencia (IMD), también es crucial para la competencia vectorial de mosca de arena Phlebotomus papatasi para Leishmania major⁴. Un papel crítico para las vías de respuesta inmune de insectos vectoriales en el control de su transmisión de patógenos infecciosos se ha notificado de manera similar en los mosquitos Aedes aegypti ^5,6,7, en la mosca de la tsetse Glossina morsitans^8,y en Anopheles gambiae mosquitos^9,10.

Los estudios de las interacciones entre mosca de la arena/Leishmania se han visto limitados por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos insectos. Sólo se había realizado la regulación de la bajada genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA)^11,12,13,14 hasta hace poco. La técnica, limitada por la mortalidad asociada con la microinyección de las hembras adultas, conduce sólo a una pérdida parcial de la función, que no puede transmitirse de generación en generación.

La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la investigación genómica funcional en organismos no modelo como las moscas de arena. Modificado desde el sistema inmune adaptativo en prokaryotes para la defensa contra bacteriófagos^15,16, el sistema CRISPR Cas9 se ha adaptado rápidamente como una herramienta de edición del genoma para organismos eucariotas superiores, incluyendo insectos. El principio de la edición del genoma objetivo CRISPR/Cas9 se basa en la complementariedad de un ARN guía único (sgRNA) a un locus genómico específico. La nucleasa Cas9 se une al sgRNA y crea una rotura de ADN de doble hebra (dsDNA) en el ADN genómico donde el esgRNA se asocia con su secuencia complementaria. El complejo Cas9-sgRNA se guía a la secuencia de destino por 17 a 20 bases complementarias en el sgRNA al locus elegido, la rotura dsDNA puede ser reparada por dos vías independientes: unión final nohomóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR)^17. La reparación de NHEJ implica un cierre simple de la rotura, pero con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción/eliminación. La reparación del ADN a través de HDR utiliza una molécula de ADN de donante que comparte la homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Los insectos poseen ambas máquinas.

La tecnología CRISPR/Cas9 puede generar mutaciones en un locus elegido, a través de la vía de reparación del NHEJ; o para estrategias de edición del genoma más complejas, como knock-ins o reporteros de expresión, a través de la vía HDR con una plantilla de donante adecuada. En moscas de arena, se generaron alelos mutantes nulos del factor de respuesta inmune Sabor a través de CRISPR mediado por NHEJ en Phlebotomus papatasi⁴. También se inyectaron embriones de mosca de arena en otro estudio con una mezcla CRISPR/Cas9 dirigida al gen que codifica el amarillo. Aún así, no se produjeron adultos portadores de la mutación^18. Aquí describimos un método detallado de mosca de arena dirigida mutagénesis por CRISPR/Cas9 mediada por NHEJ, con un enfoque particular en la microinyección embrionaria, un paso crítico del protocolo.