CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射
Summary
このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。
Abstract
サンドハエは リーシュマニア 種の自然ベクターであり、原虫寄生虫は皮病変から内臓病理に至るまで幅広い症状を生み出す。ベクター/寄生虫相互作用の性質を解読することは、 リーシュマニア の宿主への伝達をよりよく理解するために重要である。砂飛ぶベクトル能力を制御するパラメータ(すなわち、病原体を運び、伝達する能力)の中で、これらの昆虫に固有のパラメータが重要な役割を果たすることが示された。昆虫免疫応答は、例えば、 リーシュマニアに対するサンドフライベクター能力に影響を与える。このようなパラメータの研究は、これらの非モデル生物での使用に適応した遺伝子発現修飾の方法の欠如によって制限されている。小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションは可能ですが、技術的に困難であることに加えて、サイレンシングは機能の部分的な損失をもたらし、世代から世代へと伝えることはできません。CRISPR/Cas9技術による標的突然変異誘発は、最近 、フレボトムスパパタシ サンドフライに適応した。この技術は、特異的に選択された遺伝子座における転化可能な突然変異の生成につながり、目的の遺伝子を研究することを可能にする。CRISPR/Cas9システムは、後に非相同エンドジョイングレンス(NHEJ)または相同性駆動修復(HDR)のいずれかによって修復されたターゲット二本鎖DNA切断の誘導に依存しています。NHEJは、休憩の単純なクロージャで構成され、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながります。対照的に、HDRは、標的DNAと相同性を共有するドナーDNA分子の存在を修復のテンプレートとして使用する。ここでは、これまでにサンドフライベクターに適応した唯一のゲノム修飾技術であるNHEJを用いたCRISPR/Cas9による標的変異誘発に対するサンドフライ胚微小注入法を提示する。
Introduction
ベクター媒介性疾患は、絶え間ない進化における公衆衛生上の大きな脅威です。世界保健機関(WHO)によると、非常に異なる系統形成家族(蚊、ダニ、ノミなど)に広がる何百ものベクター種が膨大な数の微生物病原体の伝染を引き起こし、その結果、年間70万人以上の人が死亡する。ベクター昆虫の中で、フレボトミン砂ハエ(ディプテラ、サイコディダエ)は広大な群を構成し、80種の実証済みベクター種が異なる地理的領域で見られる明確な現象学的形質およびベクター能力を示す。彼らは リーシュマニア属の原虫寄生虫のベクターであり、リーシュマニアーゼの約130万人の新しい症例を引き起こし、年間約20,000〜30,000人の死亡を引き起こす。リーシュマニアーゼ臨床転帰は多様であり、自己制限的な皮病変から治療がない場合には致命的な内臓播種に至るまで症状が広がる。
砂のハエは厳密に地上の昆虫です。他のディプテラと比較して比較的長いライフサイクルは、温度、湿度、栄養などの異なるパラメータに応じて、最大3ヶ月間続きます。それは1つの胚段階(6〜11日)、4つの幼虫段階(合計23〜25日間持続する)と1つのプパル段階(9〜10日)とそれに続く変態と成人から構成される。砂のハエは飼育のために湿気と暖かい環境を必要とします。オスもメスも、花の蜜から野生で得られる糖を食べる。卵の生産のために血液の食事から得られるタンパク質を必要とするので、女性だけが血液供給剤である。
研究の重要な焦点は、伝染性感染症の発症につながるベクター/寄生虫相互作用の性質を特定することです。他のベクター昆虫と同様に、砂ハエに固有のパラメータは、病原体を宿主に運び、伝染する能力として定義されるベクター能力に影響を与えることを示している。例えば、フレボトムス・パパタシサンドフライミドグ細胞によるガレクチンの発現は、寄生虫表面成分を認識する受容体として作用し、リーシュマニアメジャー2,3に対するそれらのベクター能力に直接影響を及ぼすことができる。昆虫免疫応答経路は、免疫不全(IMD)、リーシュマニアメジャー4のフレボトムスパパタシサンドフライベクター能力にも極めて重要である。感染性病原体の伝染を制御するベクター昆虫免疫応答経路の重要な役割は、Aedes aegypti蚊5、6、7、ツェツェフライグロッシナ・モルシタンス8、アノフェレスガンビア蚊9、10でも同様に報告されている。
サンドフライ/リーシュマニア相互作用の研究は、これらの昆虫での使用に適応した遺伝子発現修飾法の欠如によって制限されている。最近まで11、12、13、14の小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションのみが行われていた。この技術は、成人女性の微小注射に関連する死亡率によって制限され、機能の部分的な喪失しか起こらず、世代から世代へと伝達することができない。
CRISPR/Cas9技術は、砂ハエなどの非モデル生物の機能ゲノム研究に革命をもたらしています。バクテリオファージ15、16に対する防御のために原核生物中の適応免疫系から改変され、CRISPR Cas9システムは昆虫を含む優れた真核生物のゲノム編集ツールとして急速に適応されている。CRISPR/Cas9の標的ゲノム編集の原理は、特定のゲノム遺伝子座に対する単一ガイドRNA(sgRNA)の相補性に基づいています。Cas9ヌクレアーゼはsgRNAに結合し、sgRNAがその相補配列に関連するゲノムDNAに二本鎖DNA(dsDNA)破断を生み出します。Cas9-sgRNA複合体は、sgRNA中の17〜20の相補塩基によって標的配列に導かれ、dsDNAブレークは、次いで2つの独立した経路によって修復することができる:非相同端接合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)17。NHEJの修復は、休憩の単純な閉鎖を伴うが、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながる。HDRによるDNA修復は、ドナーDNA分子共有相同性を標的DNAとの間で修復用のテンプレートとして使用します。昆虫は両方の機械を持っています。
CRISPR/Cas9技術は、NHEJ修復経路を介して、選択された遺伝子座に突然変異を生成することができます。または、適切なドナーテンプレートを使用してHDR経路を介して、ノックインや発現レポーターなどのより複雑なゲノム編集戦略のために。サンドハエでは、免疫応答因子Relishの ヌル 変異対立体が 、フレボトムス・パパタシ4においてNHEJ媒介CRISPRを介して生成された。サンドフライ胚はまた、黄色をコードする遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9ミックスを用いた別の研究で注射された。それでも、突然変異を運ぶ成人は18を産生しなかった。ここでは、NHEJ媒介CRISPR/Cas9による砂飛球標的突然変異誘発の詳細な方法について説明し、特にプロトコルの重要なステップである胚微小注射に焦点を当てる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、フレボトムスパパタシサンドハエでCRISPR/Cas9による標的性変異誘発のための最近開発された胚微小注射法を紹介する。昆虫遺伝子改変のための胚微小注射は、1980年代半ばにショウジョウバエで開発され、現在では多種多様な昆虫に日常的に使用されています。遺伝子組み換え物質の送達のための他の方法は、例えばReMOT20、21、22…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ヴァネッサ・メルデナー=ハレルが原稿を批判的に読んでくれて感謝している。
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
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