CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu
Summary
Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.
Abstract
Kum sinekleri, leishmania türleri için doğal vektörlerdir, protozoan parazitler, fetüs lezyonlarından viseral patolojiye kadar geniş bir semptom spektrumu üretir. Vektör / parazit etkileşimlerinin doğasının deşifre edilmesi, leishmania iletiminin konaklarına daha iyi anlaşılması için birincil öneme sahiptir. Kum sineği vektör yeterliliğini kontrol eden parametreler arasında (yani patojenleri taşıma ve iletme yetenekleri), bu böceklere içsel parametrelerin kilit rol oynadığı gösterilmiştir. Örneğin, böcek immün yanıtı, Leishmania’yakum sineği vektör yeterliliğini etkiler. Bu tür parametrelerin incelenmesi, bu model olmayan organizmalarda kullanılmak üzere uyarlanmış gen ekspresyon modifikasyon yöntemlerinin eksikliği ile sınırlanmıştır. Küçük müdahale RNA ‘sı (siRNA) ile gen küçültme mümkündür, ancak teknik olarak zorlayıcı olmasının yanı sıra, susturma, nesilden nesile bulaşamayan sadece kısmi bir işlev kaybına yol açar. CRISPR/Cas9 teknolojisi ile hedeflenen mutagenesis yakın zamanda Phlebotomus papatasi kum sineğine uyarlandı. Bu teknik, özellikle seçilmiş bir lokusta aktarılabilir mutasyonların üretilmesine yol açarak ilgi genlerinin incelenmesine izin verir. CRISPR/Cas9 sistemi, daha sonra Homolog Olmayan Sonlandırma Birleştirme (NHEJ) veya Homology Driven Repair (HDR) tarafından onarılan hedeflenen çift iplikli DNA molalarının indüksiyonuna dayanır. NHEJ, kesmenin basit bir şekilde kapatılmasından oluşur ve sık sık küçük ekleme/silme olaylarına yol açar. Buna karşılık HDR, homolojiyi hedef DNA ile paylaşan bir donör DNA molekülünün varlığını onarım için bir şablon olarak kullanır. Burada, bugüne kadar kum sineği vektörlerine uyarlanmış tek genom modifikasyon tekniği olan NHEJ kullanılarak CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen mutajensis için bir kum sineği embriyo mikroenjeksiyon yöntemi sunuyoruz.
Introduction
Vektör kaynaklı hastalıklar sürekli evrimde önemli bir halk sağlığı tehdididir. Dünya Sağlık Örgütü’ne göre, çok farklı filojenik ailelere yayılmış yüzlerce vektör türü (örneğin sivrisinekler, keneler, pireler) yılda 700.000’den fazla insan ölümüyle sonuçlanan çok sayıda mikrobiyal patojenin bulaşmasından sorumludur. Vektör böcekler arasında, fenbotomik kum sinekleri (Diptera, Psychodidae), farklı coğrafi bölgelerde bulunan farklı fenotipik özellikler ve vektörel kapasiteler sergileyen kanıtlanmış 80 vektör türü ile geniş bir grup oluşturur. Leishmaniacinsinin protozoan parazitleri için vektörlerdir Yaklaşık 1.3 milyon yeni Leishmaniases vakasına ve yılda 20.000 ila 30.000 ölüme neden olan. Leishmaniases klinik sonuçları, kendi kendini sınırlayan keseli lezyonlardan tedavinin yokluğunda ölümcül olan viseral yayılıma kadar çeşitli semptomlarla çeşitlidir.
Kum sinekleri kesinlikle karasal böceklerdir. Diğer Diptera’lara kıyasla nispeten uzun olan yaşam döngüleri, sıcaklık, nem ve beslenme gibi farklı parametrelere bağlı olarak üç aya kadar sürer. Bir embriyonik evre (6 ila 11 gün), dört larva evresi (toplam 23 ila 25 gün sürer) ve bir pupal evreden (9 ila 10 gün) ve ardından metamorfoz ve daha sonra yetişkinlikten oluşur. Kum sinekleri yetiştirme için nemli ve sıcak bir ortam gerektirir. Hem erkekler hem de dişiler, çiçek nektarlarından vahşi doğada elde edilen şekerlerle beslenir. Sadece dişiler kan besleyicidir, çünkü yumurta üretimi için kan yemeğinden elde edilen proteinlere ihtiyaç duyarlar1.
Araştırmanın önemli bir odağı, aktarılabilir enfeksiyonların gelişmesine yol açan vektör / parazit etkileşimlerinin doğasını belirlemektir. Diğer vektör böceklerde olduğu gibi, kum sineklerine içsel parametrelerin, patojenleri konaklarına taşıma ve iletme yetenekleri olarak tanımlanan vektör yeterliliklerini etkilediği gösterilmiştir. Örneğin, parazit yüzey bileşenlerini tanıyan reseptörler olarak hareket eden Phlebotomus papatasi kum sineği midgut hücreleri tarafından galektinlerin ifadesi, Leishmania majör2,3için vektör yetkinliklerini doğrudan etkileyebilir. Böcek immün yanıt yolu, İmmün Yetmeme (IMD), Leishmania major4için Phlebotomus papatasi kum sineği vektör yeterliliği için de çok önemlidir. Vektör böcek immün yanıt yolları için enfeksiyöz patojenlerin iletimini kontrol etmede kritik bir rol benzer şekilde Aedes aegypti sivrisineklerinde5,6,7, tsetse fly Glossina morsitans8ve Anopheles gambiya sivrisineklerinde 9,10.
Kum sineği/Leishmania etkileşimleri çalışmaları, bu böceklerde kullanılmak üzere uyarlanmış gen ekspresyon modifikasyon yöntemlerinin eksikliği ile sınırlı olmuştur. Yakın zamana kadar sadece küçük müdahale RNA’sı (siRNA) ile gen küçültme11,12,13,14 olarak gerçekleşmiştir. Yetişkin kadınların mikroenjeksiyonu ile ilişkili mortalite ile sınırlı olan teknik, sadece nesilden nesile bulaşamayan kısmi bir işlev kaybına yol açar.
CRISPR/Cas9 teknolojisi, kum sinekleri gibi model olmayan organizmalarda fonksiyonel genomik araştırmalarda devrim yaratmamıştır. Bakteriyofajlara karşı savunma için prokaryotlardaki adaptif bağışıklık sisteminden modifiye edilmiş15,16, CRISPR Cas9 sistemi, böcekler de dahil olmak üzere üstün ökaryotik organizmalar için bir genom düzenleme aracı olarak hızla uyarlanmıştır. CRISPR/Cas9 hedefli genom düzenleme prensibi, tek bir kılavuz RNA’nın (sgRNA) belirli bir genomik lokusa tamamlayıcılığına dayanmaktadır. Cas9 çekirdeği sgRNA’ya bağlanır ve sgRNA’nın tamamlayıcı dizisiyle ilişkilendirildiği genomik DNA’da çift iplikli DNA (dsDNA) kırılması oluşturur. Cas9-sgRNA kompleksi, sgRNA’daki 17 ila 20 tamamlayıcı taban tarafından seçilen çekirgeye yönlendirilir, dsDNA kırılması daha sonra iki bağımsız yol ile onarılabilir: nonhomologous end joining (NHEJ) veya homology-directed repair (HDR)17. NHEJ onarımı, kesmenin basit bir şekilde kapatılmasını içerir, ancak genellikle küçük ekleme/silme olaylarına yol açar. HDR aracılığıyla DNA onarımı, onarım için bir şablon olarak hedef DNA ile homolojiyi paylaşan bir donör DNA molekülü kullanır. Böcekler her iki makineye de sahiptir.
CRISPR/Cas9 teknolojisi, NHEJ onarım yolundan seçilen bir çekirgede mutasyonlar oluşturabilir; veya uygun bir donör şablonuna sahip HDR yolundan darbeler veya ifade muhabirleri gibi daha karmaşık genom düzenleme stratejileri için. Kum sineklerinde, phlebotomus papatasi4’teNHEJ aracılı CRISPR aracılığıyla immün yanıt faktörü Relish’in boş mutant alelleri üretildi. Kum sineği embriyoları da başka bir çalışmada Sarı kodlayan geni hedefleyen crispr/cas9 karışımı ile enjekte edildi. Yine de, mutasyonu taşıyan hiçbir yetişkin üretilmedi18. Burada, protokolün kritik bir adımı olan embriyo mikroenjeksiyonuna odaklanarak NHEJ aracılı CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen ayrıntılı bir kum sineği hedefli mutagenezi yöntemini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada Phlebotomus papatasi kum sineklerinde CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen mutajensis için yakın zamanda geliştirilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon yöntemini sunuyoruz. Böcek genetik modifikasyonu için embriyo mikroenjeksiyon 1980’lerin ortalarında Drosophila’da geliştirilmiştir21 ve şimdi rutin olarak çok çeşitli böceklerde kullanılmaktadır. ReMOT 20 , 21 , 22,23 ve elektroporasyon23<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Vanessa Meldener-Harrell’e makalenin eleştirel okuması için teşekkür eder.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant’Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant’anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant’Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
