Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9
Summary
Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.
Abstract
Moscas de areia são os vetores naturais da espécie Leishmania, parasitas protozoários produzindo um amplo espectro de sintomas que vão desde lesões cutâneas até patologia visceral. Decifrar a natureza das interações vetor/parasita é de importância primária para uma melhor compreensão da transmissão de Leishmania aos seus hospedeiros. Entre os parâmetros que controlam a competência vetorial da mosca de areia (ou seja, sua capacidade de transportar e transmitir patógenos), parâmetros intrínsecos a esses insetos mostraram-se um papel fundamental. A resposta imune a insetos, por exemplo, impacta a competência vetorial da mosca da areia para a Leishmania. O estudo desses parâmetros tem sido limitado pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses organismos não-modelo. A baixa genética por RNA de pequena interferência (siRNA) é possível, mas além de ser tecnicamente desafiador, o silenciamento leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração. Mutagênese direcionada pela tecnologia CRISPR/Cas9 foi recentemente adaptada para a mosca de areia Phlebotomus papatasi. Essa técnica leva à geração de mutações transmissíveis em um lócus especificamente escolhido, permitindo estudar os genes de interesse. O sistema CRISPR/Cas9 conta com a indução de quebras de DNA de dois fios direcionados, posteriormente reparados por NHEJ (Non-Homólogos End Joining) ou por Homology Driven Repair (HDR). O NHEJ consiste em um simples fechamento da quebra e frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. Em contraste, o HDR usa a presença de uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Aqui, apresentamos um método de microinjeção de embriões de mosca de areia para mutagênese direcionada pelo CRISPR/Cas9 usando NHEJ, que é a única técnica de modificação do genoma adaptada aos vetores de mosca de areia até o momento.
Introduction
As doenças transmitidas por vetores são uma grande ameaça à saúde pública em constante evolução. Centenas de espécies vetoriais espalhadas por famílias filogênicas muito distintas (por exemplo, mosquitos, carrapatos, pulgas) são responsáveis pela transmissão de um grande número de patógenos microbianos, resultando em mais de 700.000 mortes humanas por ano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Entre os insetos vetoriais, as moscas de areia de flebotomina (Diptera, Psychodidae) constituem um vasto grupo, com 80 espécies vetoriais comprovadas exibindo traços fenotípicos distintos e capacidades vetoriais encontradas em diferentes regiões geográficas. São vetores para os parasitas protozoários do gênero Leishmania,causando cerca de 1,3 milhão de novos casos de Leishmanioses e entre 20.000 e 30.000 mortes por ano. Os desfechos clínicos das leishmanioses são diversos, com sintomas que vão desde lesões cutâneas auto-limitantes até disseminação visceral que é fatal na ausência de tratamento.
Moscas de areia são insetos estritamente terrestres. Seu ciclo de vida, relativamente longo em comparação com outros Diptera, dura até três meses, dependendo de diferentes parâmetros, como temperatura, umidade e nutrição. Consiste em um estágio embrionário (6 a 11 dias), quatro estágios larvais (com duração total de 23 a 25 dias) e um estágio pupal (9 a 10 dias) seguido de metamorfose e depois idade adulta. Moscas de areia requerem um ambiente úmido e quente para a criação. Tanto machos quanto fêmeas se alimentam de açúcares, obtidos na natureza a partir de néctars de flores. Apenas as fêmeas são alimentadores de sangue, pois necessitam de proteínas obtidas da farinha de sangue para a produção de ovos1.
Um foco importante da pesquisa é identificar a natureza das interações vetor/parasita que levam ao desenvolvimento de infecções transmissíveis. Assim como outros insetos vetoriais, parâmetros intrínsecos às moscas de areia têm mostrado impacto em sua competência vetorial, que é definida como sua capacidade de transportar e transmitir patógenos para seus hospedeiros. Por exemplo, a expressão de galectinas pelos phlebotomus papatasi e células midgut de mosca, agindo como receptores reconhecendo componentes da superfície parasita, pode influenciar diretamente sua competência vetorial para Leishmania maior2,3. A via de resposta imune ao inseto, Immune Deficiency (IMD), também é crucial para a competência vetorial de phlebotomus papatasi para a Leishmania maior4. Um papel crítico para as vias de resposta imune a insetos vetoriais no controle de sua transmissão de patógenos infecciosos tem sido relatado da mesma forma nos mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, na mosca tsé-tsé Glossina morsitans8, e em Anopheles gárdias mosquitos 9,10.
Estudos de interações de moscas deareia/Leishmania têm sido limitados pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses insetos. Apenas a desregulamentação genética por RNA de pequena interferência (siRNA) havia sido realizada11,12,13,14 até recentemente. A técnica, limitada pela mortalidade associada à microinjeção de fêmeas adultas, leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração.
A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a pesquisa genômica funcional em organismos não-modelo, como moscas de areia. Modificado do sistema imunológico adaptativo em procariotes para defesa contra bacteriófagos15,16, o sistema CRISPR Cas9 foi rapidamente adaptado como uma ferramenta de edição de genomas para organismos eucarióticos superiores, incluindo insetos. O princípio da edição de genoma direcionada do CRISPR/Cas9 baseia-se na complementaridade de um único guia RNA (sgRNA) a um lócus genômico específico. A nuclease Cas9 se liga ao sgRNA e cria uma quebra de DNA de duas vertentes (dsDNA) no DNA genômico onde o sgRNA se associa à sua sequência complementar. O complexo Cas9-sgRNA é guiado à sequência de destino por 17 a 20 bases complementares no sgRNA para o lócus escolhido, o rompimento dsDNA pode então ser reparado por duas vias independentes: junção final nonhomologous (NHEJ) ou reparo direcionado à homologia (HDR)17. O reparo do NHEJ envolve um simples fechamento do intervalo, mas frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. A reparação de DNA através do HDR usa uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Insetos possuem ambas as máquinas.
A tecnologia CRISPR/Cas9 pode gerar mutações em um lócus escolhido, através da via de reparo NHEJ; ou para estratégias de edição de genomas mais complexas, como knock-ins ou repórteres de expressão, através da via HDR com um modelo de doador apropriado. Em moscas de areia, alelos mutantes nulos do fator de resposta imune Relish foram gerados através de CRISPR mediado por NHEJ em Phlebotomus papatasi4. Embriões de mosca de areia também foram injetados em outro estudo com uma mistura CRISPR/Cas9 visando a codificação genética Amarela. Ainda assim, nenhum adulto portador da mutação foi produzido18. Descrevemos aqui um método detalhado de mutagênese direcionada à mosca-da-areia pelo CRISPR/Cas9 mediado pela NHEJ, com um foco particular na microinjeção do embrião, um passo crítico do protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui um método de microinjeção de embriões recentemente desenvolvido para mutagênese direcionada por CRISPR/Cas9 em moscas de areia Phlebotomus papatasi. A microinjeção de embriões para modificação genética de insetos foi desenvolvida em Drosophila em meados da década de 198021 e agora é usada rotineiramente em uma grande variedade de insetos. Outros métodos para a entrega de materiais de modificação genética foram desenvolvidos para uso em insetos, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Vanessa Meldener-Harrell pela leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
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