Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese
Summary
Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.
Abstract
Zandvliegen zijn de natuurlijke vectoren voor Leishmania-soorten, protozoaanse parasieten die een breed spectrum van symptomen produceren, variërend van cutane laesies tot viscerale pathologie. Het ontcijferen van de aard van de vector/parasiet interacties is van primair belang voor een beter begrip van Leishmania transmissie naar hun gastheren. Onder de parameters die de competentie van de zandvliegvector controleren (d.w.z. hun vermogen om ziekteverwekkers te dragen en over te dragen), bleken parameters die inherent zijn aan deze insecten een sleutelrol te spelen. Insecten immuunrespons, bijvoorbeeld, beïnvloedt zandvlieg vector competentie naar Leishmania. De studie van dergelijke parameters is beperkt door het ontbreken van methoden voor genexpressiemodificatie die zijn aangepast voor gebruik in deze niet-modelorganismen. Gen downregulatie door kleine interfererende RNA (siRNA) is mogelijk, maar naast het feit dat het technisch uitdagend is, leidt het uitschakeling tot slechts een gedeeltelijk functieverlies, dat niet van generatie op generatie kan worden overgedragen. Gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 technologie is onlangs aangepast aan de Phlebotomus papatasi zandvlieg. Deze techniek leidt tot het genereren van overdraagbare mutaties in een specifiek gekozen locus, waardoor de genen van belang kunnen worden bestudeerd. Het CRISPR/Cas9-systeem is gebaseerd op de inductie van gerichte dubbelstrengs DNA-breuken, later gerepareerd door non-homologous end joining (NHEJ) of door Homology Driven Repair (HDR). NHEJ bestaat uit een eenvoudige afsluiting van de pauze en leidt vaak tot kleine invoeg-/verwijderingsgebeurtenissen. HDR gebruikt daarentegen de aanwezigheid van een donor-DNA-molecuul dat homologie deelt met het doel-DNA als sjabloon voor reparatie. Hier presenteren we een zandvliegembryomicro-injectiemethode voor gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 met behulp van NHEJ, de enige genoommodificatietechniek die tot nu toe is aangepast aan zandvliegvectoren.
Introduction
Vector-overgedragen ziekten zijn een grote bedreiging voor de volksgezondheid in constante evolutie. Honderden vectorsoorten verspreid over zeer verschillende fylogene families (bijv. muggen, teken, vlooien) zijn verantwoordelijk voor de overdracht van een groot aantal microbiële pathogenen, wat volgens de Wereldgezondheidsorganisatie resulteert in meer dan 700.000 menselijke sterfgevallen per jaar. Onder vectorinsecten vormen flebotominezandvliegen (Diptera, Psychodidae) een enorme groep, met 80 bewezen vectorsoorten die verschillende fenotypische eigenschappen en vectoriële capaciteiten vertonen die in verschillende geografische regio’s worden aangetroffen. Het zijn vectoren voor de protozoaanse parasieten van het geslacht Leishmania, die ongeveer 1,3 miljoen nieuwe gevallen van Leishmaniases en tussen de 20.000 en 30.000 sterfgevallen per jaar veroorzaken. De klinische resultaten van Leishmaniases zijn divers, met symptomen variërend van zelfbeperkende cutane laesies tot viscerale verspreiding die fataal is bij afwezigheid van behandeling.
Zandvliegen zijn strikt terrestrische insecten. Hun levenscyclus, relatief lang in vergelijking met andere Diptera, duurt maximaal drie maanden, afhankelijk van verschillende parameters zoals temperatuur, vochtigheid en voeding. Het bestaat uit één embryonaal stadium (6 tot 11 dagen), vier larvale stadia (die in totaal 23 tot 25 dagen duren) en één popstadium (9 tot 10 dagen) gevolgd door metamorfose en vervolgens volwassenheid. Zandvliegen vereisen een vochtige en warme omgeving voor de opfok. Zowel mannetjes als vrouwtjes voeden zich met suikers, in het wild verkregen uit bloemnectars. Alleen vrouwtjes zijn bloedvoeders, omdat ze eiwitten nodig hebben die zijn verkregen uit het bloedmeel voor de productie van eieren1.
Een belangrijk aandachtspunt van onderzoek is het identificeren van de aard van de vector/parasiet interacties die leiden tot de ontwikkeling van overdraagbare infecties. Net als bij andere vectorinsecten is aangetoond dat parameters die inherent zijn aan zandvliegen van invloed zijn op hun vectorcompetentie, die wordt gedefinieerd als hun vermogen om ziekteverwekkers naar hun gastheren te dragen en over te dragen. Bijvoorbeeld, de uitdrukking van galectines door de Phlebotomus papatasi zandvlieg midgut cellen, die fungeren als receptoren die parasietoppervlakcomponenten herkennen, kunnen hun vectorcompetentie voor Leishmania major2,3direct beïnvloeden . De insect immuunrespons route, Immune Deficiency (IMD), is ook cruciaal voor de Phlebotomus papatasi zandvlieg vector competentie voor Leishmania major4. Een cruciale rol voor vector insect immuunresponsroutes bij het beheersen van hun overdracht van infectieuze pathogenen is op dezelfde manier gemeld bij Aedes aegypti muggen5,6,7, in de tseetseevlieg Glossina morsitans8, en in Anopheles gambiae muggen9,10.
Studies van zandvlieg /Leishmania interacties zijn beperkt door het ontbreken van genexpressiemodificatiemethoden aangepast voor gebruik bij deze insecten. Tot voor kort werden alleen gen downregulatie door klein interfererend RNA (siRNA) uitgevoerd11,12,13,14. De techniek, beperkt door de mortaliteit geassocieerd met de micro-injection van volwassen vrouwtjes, leidt slechts tot een gedeeltelijk verlies van functie, dat niet van generatie op generatie kan worden overgedragen.
CRISPR/Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in functioneel genomisch onderzoek in niet-modelorganismen zoals zandvliegen. Aangepast van het adaptieve immuunsysteem in prokaryoten voor verdediging tegen bacteriofagen15,16, is het CRISPR Cas9-systeem snel aangepast als een genoombewerkingstool voor superieure eukaryotische organismen, waaronder insecten. Het principe van CRISPR/Cas9 gerichte genoombewerking is gebaseerd op de complementariteit van een enkele guide RNA (sgRNA) tot een specifieke genomische locus. De Cas9 nuclease bindt zich aan de sgRNA en creëert een dubbelstrengs DNA (dsDNA) breuk in het genomische DNA waar de sgRNA associeert met zijn complementaire sequentie. Het Cas9-sgRNA-complex wordt door 17 tot 20 complementaire bases in de sgRNA naar de gekozen locus geleid, de dsDNA-breuk kan vervolgens worden gerepareerd door twee onafhankelijke trajecten: niet-homologe eindaanvoeging (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR)17. NHEJ-reparatie omvat een eenvoudige sluiting van de onderbreking, maar leidt vaak tot kleine invoeg- / verwijderingsgebeurtenissen. DNA-reparatie via HDR maakt gebruik van een donor-DNA-molecuul dat homologie deelt met het doel-DNA als sjabloon voor reparatie. Insecten bezitten beide machines.
CRISPR/Cas9-technologie kan mutaties genereren in een gekozen locus, via het NHEJ-reparatietraject; of voor complexere genoombewerkingsstrategieën, zoals knock-ins of expressiereporters, via het HDR-traject met een geschikte donorsjabloon. Bij zandvliegen werden null mutante allelen van de immuunresponsfactor Relish gegenereerd via NHEJ-gemedieerde CRISPR in Phlebotomus papatasi4. Zandvliegembryo’s werden ook geïnjecteerd in een andere studie met een CRISPR/Cas9-mix gericht op het gen dat codeert voor Geel. Toch werden er geen volwassenen geproduceerd die de mutatie droegen18. We beschrijven hier een gedetailleerde methode van zandvlieg gerichte mutagenese door NHEJ-gemedieerde CRISPR / Cas9, met een bijzondere focus op de embryomicro-injection, een kritieke stap van het protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren hier een recent ontwikkelde embryomicro-injectiemethode voor gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi zandvliegen. Embryomicro-injection voor genetische modificatie van insecten werd ontwikkeld in Drosophila in het midden van de jaren 198021 en wordt nu routinematig gebruikt bij een grote verscheidenheid aan insecten. Andere methoden voor de levering van genetisch modificatiemateriaal zijn ontwikkeld voor gebruik bij insecten, zoals ReMOT<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Vanessa Meldener-Harrell voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant’Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant’anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant’Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
