Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol

Las pérdidas globales de frutas y verduras pueden alcanzar hasta el 50% de la producción¹ y resultar principalmente de la descomposición de los alimentos causada por el deterioro de hongos en el campo o durante el almacenamiento posterior a la cosecha^2,3,a pesar del amplio empleo de fungicidas sintéticos desde mediados del siglo XX^4. El uso de estas sustancias se está reconsiderando, ya que representa graves riesgos ambientales y para la salud. A medida que las consecuencias dañinas de su uso están apareciendo en todos los ecosistemas y la evidencia de posibles impactos en la salud ha acumulado^5,6,nuevas alternativas a las viejas estrategias profilácticas se están desarrollando para los tratamientos pre y post-cosecha^7,8,9. De ahí que el reto al que nos enfrentamos sea doble. En primer lugar, las nuevas estrategias fungicidas deben mantener los niveles de eficacia de la protección alimentaria contra los fitopatógenos y, en segundo lugar, contribuir a reducir drásticamente la huella ambiental de las prácticas agrícolas. Para cumplir con este ambicioso objetivo, se están proponiendo estrategias inspiradas en las defensas naturales evolucionadas en las plantas, ya que se han destacado más de 1000 especies de plantas por sus propiedades antimicrobianas^8. Por ejemplo, las plantas que han desarrollado fungicidas naturales para luchar contra los fitopatógenos son un recurso novedoso para explorar el desarrollo de nuevos productos de biocontrol^2. Los aceites esenciales son moléculas emblemáticas de este tipo. Por ejemplo, el aceite esencial origanum protege las plantas de tomate contra el moho gris en invernaderos ¹⁰ y se ha demostrado que los aceites esenciales de solidago canadensis L. y cassia preservan las fresas postcosechadas de daños en el moho gris^11,12. Estos ejemplos ilustran que el biocontrol y, en particular, los productos derivados de plantas representan una solución que combina eficacia biológica y sostenibilidad ambiental.

Por lo tanto, las plantas son un recurso importante de moléculas de interés potencial para la industria de protección de cultivos. Sin embargo, sólo se ha propuesto que un puñado de productos vegetales se utilicen como productos de biocontrol, aunque generalmente se les reconoce como seguros, no fitotóxicos y respetuosos con el medio ambiente^2. Se han observado algunas dificultades en la transposición desde el laboratorio al campo, como la disminución de la eficacia una vez aplicada in vivo^2,9. Por lo tanto, se vuelve importante mejorar la capacidad de las pruebas de laboratorio para predecir mejor la eficacia del campo. En este contexto, los métodos de ensayo antifúngicos para productos derivados de plantas son necesarios tanto para evaluar su eficacia antifúngica como para definir sus condiciones óptimas de uso. Específicamente, los productos de biocontrol son generalmente menos eficientes que los fungicidas químicos, por lo que es importante una mejor comprensión de su modo de acción para proponer formulaciones adecuadas, identificar el modo de aplicación en los campos y definir qué etapa de desarrollo del patógeno es vulnerable al bioproducto candidato.

Los enfoques actuales que abordan las actividades antibacterianas y antifúngicas incluyen métodos de difusión como la difusión de agar-disco, dilución, bioautografía y citometría de flujo¹³. La mayoría de estas técnicas, y más específicamente, las pruebas estándar de susceptibilidad antifúnggica – ensayos de difusión y dilución de disco de agar – están bien adaptadas para evaluar la actividad antimicrobiana de compuestos solubles en esporas bacterianas y fúngicas en suspensiones líquidas¹⁴. Sin embargo, estos métodos generalmente no son adecuados para probar compuestos sólidos como el polvo vegetal seco o cuantificar la actividad antifúngica durante el crecimiento del micelio, ya que requieren dilución de esporas o esporas que se extienden en placas de agar y/o dilución de compuestos antifúngicos¹³. En el método envenenado por alimentos, las placas de agar que contienen el agente antifúngico se inoculan con un disco de 5-7 mm de diámetro muestreado a partir de un cultivo de hongos de 7 días de antigüedad sin tener en cuenta la cantidad precisa de micelio inicial. Después de la incubación, la actividad antifúngica se determina como un porcentaje de la inhibición del crecimiento radial^17,18,19. Con este enfoque podemos evaluar la actividad antifúnggica en el crecimiento micelial. Por el contrario, se realiza el método de dilución del agar para determinar la actividad antifúngica en esporas directamente inoculadas en la superficie de la placa de agar que contiene los compuestos antifúngicos^13,20,21. Estos dos enfoques dan resultados complementarios sobre la actividad antifúnggica. Sin embargo, se trata de dos técnicas independientes utilizadas en paralelo que no proporcionan una comparación precisa en paralelo de la eficacia relativa de los compuestos antifúngicos en esporas y micelio^17,20,22 a medida que la cantidad de material fúngico inicial difiere en los dos enfoques. Además, la actividad antifúngica de un producto derivado de la planta a menudo es el resultado de la combinación de moléculas antifúngicas sintetizadas por las plantas para hacer frente a patógenos. Estas moléculas abarcan proteínas, péptidos^23,24, y metabolitos con amplia diversidad química y pertenecientes a diferentes clases de moléculas como polifenoles, terpenos, alcaloïds²⁵, glucosinolatos⁸, y compuestos de organosulfur²⁶. Algunas de estas moléculas son volátiles o se vuelven volátiles durante el ataque de patógenos²⁷. Estos agentes suelen ser compuestos solubles en agua y de alta presión de vapor que deben recuperarse a través de la destilación de agua como aceites esenciales, algunas de cuyas actividades antimicrobianas han sido bien establecidas²⁸. Se han desarrollado ensayos de susceptibilidad mediada en fase de vapor para medir la actividad antimicrobiana de compuestos volátiles después de la evaporación y migración a través de la fase de vapor²⁹. Estos métodos se basan en la introducción de compuestos antifúngicos a distancia del cultivo microbiano^{29,30,31,32,33}. En el ensayo de agar de fase de vapor comúnmente utilizado, los aceites esenciales se depositan en un disco de papel y se colocan en el centro de la cubierta de la placa De Petri a distancia de la suspensión de esporas bacterianas o fúngicas, que se propaga en medio de agar. El diámetro de la zona de inhibición del crecimiento se mide de la misma manera que para el método de difusión del agar-disco^20,24. Se han desarrollado otros enfoques para proporcionar medición cuantitativa de la susceptibilidad antifúngica de la fase de vapor de los aceites esenciales, derivada del método de dilución de caldos a partir del cual se calculó una actividad antimicrobiana mediada en fase de vapor inhibitorio³², o derivado de ensayos de difusión de agar-disco³¹. Estos métodos son generalmente específicos de los estudios de actividad de fase de vapor y no son apropiados para los ensayos de inhibición de contacto. Esto excluye la determinación de la contribución relativa de agentes volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica de una mezcla bioactiva compleja.

El método cuantitativo que hemos desarrollado tiene como objetivo medir el efecto antifúngico del polvo de planta seca en cantidades controladas de esporas y micelio cultivado depositado en la superficie de un medio de agar para reproducir el crecimiento aéreo de fitopatógenos durante la infección de las plantas^15, así como una red micelial interconectada^16. El enfoque es una configuración experimental modificada basada en la dilución del agar y los métodos envenenados por alimentos que también permite, en la misma configuración experimental, cuantificar en paralelo la contribución de metabolitos antifúngicos volátiles y no volátiles. En este estudio, el método ha sido comparado con la actividad de tres preparaciones antifúngicas bien caracterizadas.