قياس النشاط المتطاير وغير المتطاير المضاد للفطريات لمنتجات التحكم الحيوي

يمكن أن تصل الخسائر العالمية من الفواكه والخضروات إلى 50٪ من الإنتاج¹ وتنجم في الغالب عن تسوس الأغذية الناجم عن تلف الفطريات في الحقل أو أثناء تخزين ما بعد الحصاد^2،3 ، على^الرغممن الاستخدام الواسع لمبيدات الفطريات الاصطناعية منذ منتصف القرن العشرين^4. ويجري حاليا إعادة النظر في استخدام هذه المواد لأنها تمثل مخاطر بيئية وصحية خطيرة. كما تظهر العواقب الضارة لاستخدامها في جميع أنحاء النظم الإيكولوجية والأدلة على الآثار الصحية المحتملة قد تراكمت^5،6، ويجري تطوير بدائل جديدة لاستراتيجيات وقائية قديمة لعلاج ما قبل وبعد الحصاد^7،8،9. ومن هنا يأتي التحدي الذي نواجهه من شقين. ويجب أن تحافظ الاستراتيجيات الجديدة لمبيدات الفطريات، أولا، على مستويات فعالية حماية الأغذية من الأمراض النباتية، وأن تسهم، ثانيا، في الحد بشكل كبير من البصمة البيئية للممارسات الزراعية. ولتحقيق هذا الهدف الطموح، يجري اقتراح استراتيجيات مستوحاة من الدفاعات الطبيعية التي تطورت في النباتات حيث تم تسليط الضوء على أكثر من 1000 نوع من النباتات لخصائصها المضادة للميكروبات^8. على سبيل المثال، النباتات التي طورت مبيدات الفطريات الطبيعية لمكافحة phytopathogens هي مورد جديد في استكشاف تطوير منتجات جديدة للتحكم البيولوجي². الزيوت الأساسية هي الجزيئات الرئيسية من هذا النوع. على سبيل المثال، زيت الأوريجانوم الأساسي يحمي نباتات الطماطم ضد العفن الرمادي في الدفيئات ¹⁰ وقد ثبت سوليداغو canadensis L. والزيوت الأساسية كاسيا للحفاظ على الفراولة بعد حصادها من أضرار العفن الرمادي^11،12. وتوضح هذه الأمثلة أن المكافحة البيولوجية، ولا سيما المنتجات المشتقة من النباتات، تمثل حلا يجمع بين الفعالية البيولوجية والاستدامة البيئية.

وبالتالي، فإن النباتات مورد مهم للجزيئات ذات الأهمية المحتملة لصناعة حماية المحاصيل. ومع ذلك فقد اقترح سوى عدد قليل من المنتجات النباتية لاستخدامها كمنتجات التحكم البيولوجي على الرغم من أنها معترف بها عموما على أنها آمنة وغير phytotoxic وصديقة للبيئة². وقد لوحظت بعض الصعوبات في نقل من المختبر إلى الميدان، مثل انخفاض فعالية مرة واحدة تطبق في الجسم الحي^2،9. وبالتالي، يصبح من المهم تحسين قدرة الاختبارات المعملية على التنبؤ بشكل أفضل بفعالية المجال. وفي هذا السياق، فإن طرق اختبار مضادات الفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات ضرورية لتقييم فعاليتها المضادة للفطريات وتحديد ظروفها المثلى للاستخدام. وعلى وجه التحديد، فإن منتجات المكافحة البيولوجية أقل كفاءة عموما من مبيدات الفطريات الكيميائية، ولذلك فإن من المهم فهم طريقة عملها بشكل أفضل لاقتراح تركيبات مناسبة، وتحديد طريقة التطبيق في المجالات، وتحديد المرحلة التنموية للمسبب الممرض المعرضة للمنتج البيولوجي المرشح.

وتشمل النهج الحالية التي تعالج الأنشطة المضادة للبكتيريا والفطريات أساليب الانتشار مثل نشر قرص أغار، والتخفيف، والتصوير البيولوجي، وقياس التدفق الخلوي¹³. معظم هذه التقنيات ، وبشكل أكثر تحديدا ، فإن اختبار الحساسية القياسية المضادة للفطريات – نشر قرص أجار ومقايسات التخفيف – مكيفة بشكل جيد لتقييم النشاط المضاد للميكروبات للمركبات القابلة للذوبان على الجراثيم البكتيرية والفطرية في التعليق السائل¹⁴. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل عام لاختبار المركبات الصلبة مثل مسحوق النبات المجفف أو لتحديد النشاط المضاد للفطريات أثناء نمو الميسيليوم لأنها تتطلب تخفيف البوغ أو انتشار البوغ على لوحات أجار و / أو تخفيف المركبات المضادة للفطريات¹³. في طريقة تسمم الطعام ، يتم تلقيح لوحات أجار التي تحتوي على العامل المضاد للفطريات مع قرص قطره 5-7 ملم عينات من ثقافة الفطريات القديمة لمدة 7 أيام دون النظر في الكمية الدقيقة لبدء الميسيليوم. بعد الحضانة ، يتم تحديد النشاط المضاد للفطريات على أنه نسبة مئوية من تثبيط النمو الشعاعي^17,18,19. مع هذا النهج يمكننا تقييم النشاط المضاد للفطريات على النمو mycelial. وعلى النقيض من ذلك ، يتم تنفيذ طريقة تخفيف أجار لتحديد النشاط المضاد للفطريات على الجراثيم التي تم تلقيحها مباشرة على سطح لوحة أجار التي تحتوي على المركبات المضادة للفطريات^13,20,21. يعطي هذان النهجان نتائج تكميلية على النشاط المضاد للفطريات. ومع ذلك هذه هي اثنين من التقنيات المستقلة المستخدمة بالتوازي التي لا توفر مقارنة دقيقة جنبا إلى جنب من الفعالية النسبية للمركبات المضادة للفطريات على الجراثيم والفطريات^17,20,22 كما تختلف كمية المواد الفطرية بدءا في النهجين. وعلاوة على ذلك، فإن النشاط المضاد للفطريات للمنتج المشتق من النبات غالبا ما ينتج عن الجمع بين الجزيئات المضادة للفطريات التي توليفها من قبل النباتات لمواجهة مسببات الأمراض. وتشمل هذه الجزيئات البروتينات والببتيدات^23,24، ونواتج الأيض وجود التنوع الكيميائي واسعة والانتماء إلى فئات مختلفة من جزيئات مثل البوليفينول، تيربينس، alcaloïds²⁵, الجلوكوزينولات⁸، ومركبات أورجانوسلفور²⁶. بعض هذه الجزيئات متقلبة أو تصبح متقلبة أثناء هجوم مسببات الأمراض²⁷. هذه العوامل هي في معظم الأحيان سيئة للذوبان في الماء وارتفاع مركبات الضغط بخار التي يتعين استردادها من خلال تقطير المياه والزيوت الأساسية، وبعضها قد ثبت جيدا أنشطتها المضادة للميكروبات²⁸. تم تطوير اختبارات قابلية للتأثر بوساطة مرحلة البخار لقياس النشاط المضاد للميكروبات للمركبات المتطايرة بعد التبخر والهجرة عبر مرحلة البخار²⁹. وتستند هذه الأساليب على إدخال المركبات المضادة للفطريات على مسافة من الثقافة الميكروبية^{29,30,31,32,33}. في المقايسة agar مرحلة بخار شائعة الاستخدام، يتم إيداع الزيوت الأساسية على قرص ورقي ووضعها في وسط غطاء طبق بيتري على مسافة من تعليق بوغ البكتيرية أو الفطرية، والتي تنتشر على المتوسط أجار. ثم يقاس قطر منطقة تثبيط النمو بنفس الطريقة التي تقاس بها طريقة نشر القرص الأغار^20,24. وقد تم تطوير نهج أخرى لتوفير قياس كمي للحساسية المضادة للفطريات في مرحلة البخار من الزيوت الأساسية ، المستمدة من طريقة تخفيف المرق التي تم من خلالها حساب نشاط مضاد للميكروبات بوساطة مثبطة على مرحلة البخار³²، أو مشتقة من مقايسات نشر قرص أغار³¹. هذه الأساليب هي عموما محددة لدراسات النشاط مرحلة بخار وغير مناسبة لمقاايسات تثبيط الاتصال. وهذا يحول دون تحديد المساهمة النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة في النشاط المضاد للفطريات لخليط نشط بيولوجيا معقد.

الطريقة الكمية التي طورناها تهدف إلى قياس التأثير المضاد للفطريات لمسحوق النبات المجفف على الكميات الخاضعة للرقابة من الجراثيم وزرع الميسيليوم المودع على سطح وسيط أجار لإعادة إنتاج النمو الجوي للنباتات النباتية أثناء عدوى النباتات¹⁵ وكذلك شبكة mycelial مترابطة¹⁶. النهج هو إعداد تجريبي معدل يستند إلى أساليب تخفيف أجار ومسمومة بالغذاء التي تسمح أيضا ، في نفس الإعداد التجريبي ، بالتقيم الكمي جنبا إلى جنب لمساهمة كل من الأيضات المضادة للفطريات المتطايرة وغير المتطايرة. في هذه الدراسة ، تم قياس الطريقة مقابل نشاط ثلاثة مستحضرات مضادة للفطريات تتميز بشكل جيد.