Mesure de l’activité antifongique volatile et non volatile des produits de lutte biologique

Les pertes mondiales de fruits et légumes peuvent atteindre jusqu’à 50 % de la production^{1 et} résulter principalement de la décomposition des aliments causée par la détérioration des champignons sur le terrain ou pendant le stockage post-récolte^2,3, malgré l’emploi important de fongicides synthétiques depuis le milieu du XXe siècle⁴. L’utilisation de ces substances est réexaminée puisqu’elle représente de graves risques pour l’environnement et la santé. Comme les conséquences néfastes de leur utilisation se manifestent dans tous les écosystèmes et que des preuves d’impacts potentiels sur la santé^{se sont accumulées 5,6}, de nouvelles alternatives aux anciennes stratégies prophylactiques sont en cours d’élaboration pour les traitements pré et post-récolte^7,8,9. Par conséquent, le défi auquel nous sommes confrontés est double. Les nouvelles stratégies fongicides doivent, premièrement, maintenir les niveaux d’efficacité de la protection alimentaire contre les phytopathogènes et, en même temps, contribuer, deuxièmement, à réduire considérablement l’empreinte environnementale des pratiques agricoles. Pour atteindre cet objectif ambitieux, des stratégies inspirées par les défenses naturelles évoluées dans les plantes sont proposées car plus de 1000 espèces végétales ont été mises en évidence pour leurs propriétés antimicrobiennes⁸. Par exemple, les plantes qui ont développé des fongicides naturels pour lutter contre les phytopathogènes sont une ressource nouvelle dans l’exploration du développement de nouveaux produits de lutte biologique². Les huiles essentielles sont des molécules phares de ce type. Par exemple, l’huile essentielle d’Origanum protège les plants de tomates contre la moisissure grise ^{dans les serres 10} et solidago canadensis L. et cassia huiles essentielles ont été montrés pour préserver les fraises post-récolte de dommages moule^{gris 11,12}. Ces exemples illustrent que le biocontrôle et notamment les produits dérivés des plantes représentent une solution qui combine efficacité biologique et durabilité environnementale.

Ainsi, les plantes sont une ressource importante de molécules d’intérêt potentiel pour l’industrie de la protection des cultures. Toutefois, seule une poignée de produits végétaux ont été proposés pour être utilisés comme produits de lutte biologique, même s’ils sont généralement reconnus comme sûrs, non phytotoxiques et respectueux de^{l’environnement 2}. Certaines difficultés dans la transposition du laboratoire au champ ont été observées, comme la diminution de l’efficacité une fois appliquée in vivo^2,9. Ainsi, il devient important d’améliorer la capacité des tests de laboratoire à mieux prédire l’efficacité sur le terrain. Dans ce contexte, des méthodes d’essai antifongiques pour les produits dérivés des plantes sont nécessaires à la fois pour évaluer leur efficacité antifongique et pour définir leurs conditions optimales d’utilisation. Plus précisément, les produits de lutte biologique sont généralement moins efficaces que les fongicides chimiques, de sorte qu’une meilleure compréhension de leur mode d’action est importante pour proposer des formulations appropriées, pour identifier le mode d’application dans les champs et pour définir quel stade de développement de l’agent pathogène est vulnérable au bioproduit candidat.

Les approches actuelles portant sur les activités antibactériennes et antifongiques comprennent des méthodes de diffusion telles que la diffusion du disque d’agar, la dilution, la bioautographie et la cytométrie des flux.¹³. La plupart de ces techniques, et plus particulièrement, les tests de susceptibilité antifongique standard – analyse de diffusion et de dilution du disque d’agar – sont bien adaptés pour évaluer l’activité antimicrobienne des composés solubles sur les spores bactériennes et fongiques dans les suspensions liquides.¹⁴. Toutefois, ces méthodes ne conviennent généralement pas aux essais de composés solides tels que la poudre de plantes séchées ou à quantifier l’activité antifongique pendant la croissance du mycélium, car elles nécessitent une dilution des spores ou une propagation des spores sur les plaques d’agar et/ou une dilution des composés antifongiques.¹³. Dans la méthode empoisonnée par la nourriture, les plaques d’agar contenant l’agent antifongique sont inoculées avec un disque de 5-7 mm de diamètre échantillonné à partir d’une culture de champignons de 7 jours sans tenir compte de la quantité précise de mycélium de départ. Après incubation, l’activité antifongique est déterminée comme un pourcentage d’inhibition de la croissance radiale^17,18,19. Avec cette approche, nous pouvons évaluer l’activité antifongique sur la croissance mycéliale. En revanche, la méthode de dilution de l’agar est effectuée pour déterminer l’activité antifongique sur les spores directement inoculées à la surface de la plaque d’agar contenant les composés antifongiques^13,20,21. Ces deux approches donnent des résultats complémentaires sur l’activité antifongique. Toutefois, il s’agit de deux techniques indépendantes utilisées en parallèle qui ne permettent pas de comparer côte à côte avec précision l’efficacité relative des composés antifongiques sur les spores et le mycélium.^17,20,22 comme la quantité de matériel fongique de départ diffère dans les deux approches. En outre, l’activité antifongique d’un produit dérivé des plantes résulte souvent de la combinaison de molécules antifongiques synthétisées par les plantes pour faire face à des agents pathogènes. Ces molécules englobent les protéines, les peptides^23,24, et les métabolites ayant une grande diversité chimique et appartenant à différentes classes de molécules telles que les polyphénols, terpènes, alcaloïdes²⁵, glucosinolates⁸, et les composés organosulfurés²⁶. Certaines de ces molécules sont volatiles ou deviennent volatiles lors d’une attaque d’agents pathogènes²⁷. Ces agents sont le plus souvent des composés solubles dans l’eau et à haute pression de vapeur qui doivent être récupérés par distillation de l’eau sous forme d’huiles essentielles, dont certaines activités antimicrobiennes ont été bien établies.²⁸. Des essais de susceptibilité 2métras par phase de vapeur ont été mis au point pour mesurer l’activité antimicrobienne des composés volatils après l’évaporation et la migration par la phase de vapeur²⁹. Ces méthodes sont basées sur l’introduction de composés antifongiques à distance de la culture microbienne^{29,30,31,32,33}. Dans l’analyse couramment utilisée de l’agar en phase de vapeur, les huiles essentielles sont déposées sur un disque de papier et placées au centre de la couverture de la boîte de Pétri à distance de la suspension bactérienne ou fongique des spores, qui se propage sur le milieu de l’agar. Le diamètre de la zone d’inhibition de croissance est ensuite mesuré de la même manière que pour la méthode de diffusion du disque d’agar^20,24. D’autres approches ont été développées pour fournir une mesure quantitative de la susceptibilité antifongique de phase de vapeur des huiles essentielles, dérivée de la méthode de dilution du bouillon à partir de laquelle une activité antimicrobienne ment mentée en phase de vapeur inhibitrice a été calculée³², ou dérivé d’analyses de diffusion de disque d’agar³¹. Ces méthodes sont généralement spécifiques aux études d’activité en phase de vapeur et ne conviennent pas aux essais d’inhibition de contact. Cela empêche la détermination de la contribution relative d’agents volatils et non volatils à l’activité antifongique d’un mélange bioactif complexe.

La méthode quantitative que nous avons développée vise à mesurer l’effet antifongique de la poudre de plantes séchées sur des quantités contrôlées de spores et de mycélium cultivé déposé à la surface d’un milieu d’agar pour reproduire la croissance aérienne des phytopathogènes lors de l’infection^{des plantes 15} ainsi qu’un réseau mycélial interconnecté¹⁶. L’approche est une configuration expérimentale modifiée basée sur la dilution de l’agar et les méthodes empoisonnées par les aliments qui permet également, dans la même configuration expérimentale, la quantification côte à côte de la contribution des métabolites antifongiques volatils et non volatils. Dans cette étude, la méthode a été comparée à l’activité de trois préparations antifongiques bien caractérisées.