Misurazione dell'attività antifungina volatile e non volatile dei prodotti biocontrollo

Le perdite globali di frutta e verdura possono raggiungere fino al 50% della^{produzione 1} e derivare principalmente dal decadimento alimentare causato dal deterioramento dei funghi sul campo o durante lo stoccaggio post-raccolta^2,3,nonostante l’ampia occupazione di fungicidi sintetici dalla metà del XX secolo⁴. L’uso di queste sostanze viene riconsiderato in quanto rappresenta gravi rischi per l’ambiente e la salute. Poiché le conseguenze dannose del loro uso si stanno mostrando in tutti gli ecosistemi e le prove di potenziali impatti sulla salute si^{sono accumulate 5,6}, si stanno sviluppando nuove alternative alle vecchie strategie profilattiche per i trattamenti pre e post-raccolta^7,8,9. Quindi la sfida che dobbiamo affrontare è duplice. Le nuove strategie fungicide devono, in primo luogo, mantenere i livelli di efficacia della protezione alimentare contro i fitopatogeni e, in secondo luogo, contribuire in secondo luogo a ridurre drasticamente l’impronta ambientale delle pratiche agricole. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, vengono proposte strategie ispirate alle difese naturali evolute nelle piante poiché sono state evidenziate più di 1000 specie di piante per le loro proprietà antimicrobiche⁸. Ad esempio, le piante che hanno sviluppato fungicidi naturali per combattere i fitopatogeni sono una nuova risorsa per esplorare lo sviluppo di nuovi prodotti di biocontrollo². Gli oli essenziali sono molecole di punta di questo tipo. Ad esempio, l’olio essenziale di Origanum protegge le piante di pomodoro dalla muffa grigia nelle serre ¹⁰ e gli oli essenziali Solidago canadensis L. e cassia hanno dimostrato di preservare le fragole post-raccolte dai danni della muffa^{grigia 11,12}. Questi esempi dimostrano che il biocontrollo e in particolare i prodotti di origine vegetale rappresentano una soluzione che combina efficacia biologica e sostenibilità ambientale.

Pertanto, le piante sono un’importante risorsa di molecole di potenziale interesse per l’industria della protezione delle colture. Tuttavia, solo una manciata di prodotti vegetali è stata proposta per essere utilizzata come prodotti di biocontrollo, anche se sono generalmente riconosciuti come sicuri, non fitotossici ed^{eco-compatibili 2}. Sono state osservate alcune difficoltà nella trasposizione dal laboratorio al campo, come l’efficacia che diminuisce una volta applicata in vivo^2,9. Pertanto, diventa importante migliorare la capacità dei test di laboratorio di prevedere meglio l’efficacia sul campo. In questo contesto, i metodi di prova antimicotici per i prodotti di origine vegetale sono necessari sia per valutarne l’efficacia antimicotico sia per definire le loro condizioni ottimali per l’uso. In particolare, i prodotti di biocontrollo sono generalmente meno efficienti dei fungicidi chimici, quindi una migliore comprensione del loro modo di agire è importante per proporre formulazioni adeguate, identificare le modalità di applicazione nei campi e definire quale stadio di sviluppo dell’agente patogeno è vulnerabile al bioproduttore candidato.

Gli attuali approcci che affrontano le attività antibatteriche e antifungine includono metodi di diffusione come la diffusione del disco di agar, la diluizione, la bioautografia e la citometria del flusso¹³. La maggior parte di queste tecniche, e più specificamente, i test standard di suscettibilità antifungina – test di diffusione e diluizione agar-disk – sono ben adattati per valutare l’attività antimicrobica dei composti solubili sulle spore batteriche e fungine nelle sospensioni liquide¹⁴. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente adatti per testare composti solidi come la polvere vegetale essiccata o per quantificare l’attività antifungina durante la crescita del micelio in quanto richiedono la diluizione delle spore o la diffusione di spore su piastre di agar e / o diluizione di composti antifungini¹³. Nel metodo avvelenato dal cibo, le piastre di agar contenenti l’agente antimicotico vengono inoculate con un disco di 5-7 mm di diametro campionato da una coltura di funghi vecchia di 7 giorni senza considerare la quantità precisa di micelio iniziale. Dopo l’incubazione, l’attività antimicotica è determinata come percentuale di inibizione della crescita radiale^17,18,19. Con questo approccio possiamo valutare l’attività antimicotica sulla crescita miceliale. Al contrario, il metodo di diluizione dell’agar viene eseguito per determinare l’attività antimicotica sulle spore direttamente inoculate sulla superficie della piastra di agar contenente i composti antifungini^13,20,21. Questi due approcci danno risultati complementari sull’attività antimicotica. Tuttavia queste sono due tecniche indipendenti utilizzate in parallelo che non forniscono un confronto accurato fianco a fianco dell’efficacia relativa dei composti antifungini su spore e micelio^17,20,22 poiché la quantità di materiale fungino iniziale differisce nei due approcci. Inoltre, l’attività antimicotica di un prodotto di origine vegetale è spesso il risultato della combinazione di molecole antifungine sintetizzati dalle piante per affrontare agenti patogeni. Queste molecole comprendono proteine, peptidi^23,24, e metaboliti con un’ampia diversità chimica e appartenenti a diverse classi di molecole come polifenoli, terpeni, alcaloidi²⁵, glucosinolati⁸, e composti organosolfuri²⁶. Alcune di queste molecole sono volatili o diventano volatili durante l’attacco patogeno²⁷. Questi agenti sono spesso scarsamente solubili in acqua e composti ad alta pressione di vapore che devono essere recuperati attraverso la distillazione dell’acqua come oli essenziali, alcune delle cui attività antimicrobiche sono state ben consolidate²⁸. Sono stati sviluppati saggi di suscettibilità mediati in fase di vapore per misurare l’attività antimicrobica dei composti volatili dopo l’evaporazione e la migrazione attraverso la fase di vapore²⁹. Questi metodi si basano sull’introduzione di composti antifungini a distanza dalla coltura microbica^{29,30,31,32,33}. Nel saggio di agar in fase di vapore comunemente usato, gli oli essenziali vengono depositati su un disco di carta e posizionati al centro della copertura della piastra di Petri a distanza dalla sospensione batterica o fungina della spora, che viene diffusa su un mezzo agar. Il diametro della zona di inibizione della crescita viene quindi misurato allo stesso modo del metodo di diffusione agar-disco^20,24. Altri approcci sono stati sviluppati per fornire una misurazione quantitativa della suscettibilità antifungina in fase di vapore degli oli essenziali, derivata dal metodo di diluizione del brodo da cui è stata calcolata un’attività antimicrobica mediata in fase di vapore inibitoria³², o derivati da saggi di diffusione agar-disk³¹. Questi metodi sono generalmente specifici per gli studi di attività in fase di vapore e non appropriati ai saggi di inibizione del contatto. Ciò impedisce la determinazione del contributo relativo degli agenti volatili e non volatili all’attività antimicotica di una miscela bioattiva complessa.

Il metodo quantitativo che abbiamo sviluppato mira a misurare l’effetto antimicotico della polvere vegetale essiccata su quantità controllate di spore e micelio coltivato depositato sulla superficie di un mezzo agar per riprodurre la crescita aerea dei fitopatogeni durante l’infezione^{delle piante 15 e} una rete miceliale interconnessa¹⁶. L’approccio è una configurazione sperimentale modificata basata sui metodi di diluizione dell’agar e avvelenati dagli alimenti che consente anche, nella stessa configurazione sperimentale, la quantificazione affiancata del contributo di metaboliti antifungini volatili e non volatili. In questo studio, il metodo è stato confrontato con l’attività di tre preparati antifungini ben caratterizzati.