Laboratuvarlar Arası Karşılaştırma yoluyla Sulu Medyada Altın Nanopartiküllerin Nanopartikül Takip Analizi
Summary
Burada açıklanan protokol, nanopartikül izleme analizi (NTA) ile sulu ortamda küresel nanopartiküllerin, daha spesifik olarak altın nanopartiküllerin hidrodinamik çapını ölçmeyi amaçlamaktadır. İkincisi, Brownian hareketi nedeniyle parçacıkların hareketini izlemeyi ve hidrodinamik çapı elde etmek için Stokes-Einstein denklemini uygulamayı içerir.
Abstract
Nanoteknoloji alanında analitik karakterizasyon, nanomalzemelerin (NM’ ler) davranış ve toksisitesinin anlaşılmasında hayati bir rol oynamaktadır. Karakterizasyonun eksiksiz olması ve seçilen tekniğin belirlenecek özelliğe, analiz edilen malzemeye ve bulunduğu ortama çok uygun olması gerekir. Ayrıca, veri toplama hatalarını önlemek için cihaz çalışmasının ve metodolojisinin iyi geliştirilmesi ve kullanıcı tarafından açıkça anlaşılması gerekir. Uygulanan yöntem veya yordamdaki herhangi bir tutarsızlık, elde edilen verilerin farklılıklarına ve zayıf tekrarlanabilirliğine neden olabilir. Bu makale, Nanopartikül Takip Analizi (NTA) ile altın nanopartiküllerin hidrodinamik çapını ölçme yöntemini netleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu çalışma, standart işletim prosedürünün performansını ve tekrarlanabilirliğini doğrulamak için yedi farklı laboratuvar arasında laboratuvarlar arası karşılaştırma (ILC) olarak gerçekleştirilmiştir. Bu ILC çalışmasından elde edilen sonuçlar, ayrıntılı standart işletim prosedürlerinin (SÇP’ler), en iyi uygulama güncellemelerinin, kullanıcı bilgisinin ve ölçüm otomasyonunun önemini ve faydalarını ortaya koymaktadır.
Introduction
Nanomalzemeler (NM’ler) hem fiziksel hem de kimyasal özelliklerde değişebilir, bu da davranışlarını, stabilitelerini ve toksisitelerini etkiler1,2 ,3,4,5. NM özelliklerinin, tehlikelerinin ve davranışlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasında en büyük zorluklardan biri, fiziksel ve kimyasal nanomalzeme özellikleri hakkında tekrarlanabilir bilgi elde etme yeteneğidir. Bu tür fiziksel özelliklere örnek olarak parçacık boyutu ve boyut dağılımı6, 7,8verilebilir. Bunlar, Avrupa Komisyonu’nun (AK) ‘nano’9terimini tanımlamasının önemli bir yönü olduğu için önemli parametrelerdir.
Hassas parçacık boyutu ölçümlerine ulaşmak, NMs6,10’un kaderini ve toksisite etkilerini anlamanın yanı sıra birçok farklı endüstriyel ve araştırma uygulaması ve süreci için de kritiköneme sahiptir. NM’lerin boyutunu doğru, güvenilir ve tekrarlayabilen iyi belirlenmiş yöntemlere sahip olmak önemlidir. Ayrıca, bildirilen bilgiler kullanılan tekniğin derinlemesine anlaşılmasını sağlamalıdır, örneğin boyut parametresinin türünü (örneğin, gerçek boyut veya hidrodinamik boyut) ve örnek durumu, örneğin NM’nin bulunduğu belirli ortamı ve yöntemin farklı ortamlarda güvenilir bir şekilde performans göstermesi için belirtmelidir. Boyutu ölçmek için elektron mikroskopisi (EM), dinamik ışık saçılımı (DLS), tek parçacık endüktif olarak birbirine bağlı plazma kütle spektrometresi (spICP-MS), diferansiyel sedimantasyon (DCS), tarama prob mikroskopisi (SPM), küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) ve nanopartikül izleme analizi (NTA) dahil olmak üzere bir dizi teknik kullanılabilir.
NTA, son yıllarda oldukça gelişmiş ve çevresel ilgisi olanlar gibi karmaşık sulu ortamlarda küresel NM’lerin hidrodinamik çapını güvenilir bir şekilde ölçtürüyor, örneğin tatlı su sistemleri gibi nispeten yeni bir teknolojidir. Hidrodinamik çap ‘ölçülen parçacığınkiyle aynı şekilde yayılır varsayımsal sert bir küre büyüklüğündedir’11; pratik terimlerle ve sulu ortamda bu, parçacığın yüzeyinde zayıf elektrostatik kuvvetler tarafından tutulan bir molekül tabakasını (çoğunlukla su) içeren parçacığın kendisinden daha büyük bir çapı tanımlar. Bir parçacığın hidrodinamik çapı farklı ortamlarda değişir ve ölçüldüğü ortamın iyonik gücü yükseldikçe küçülür.
NTA tekniğinin ek önemli bir özelliği, analistin EC nanomalzeme tanımı bağlamında gerekli olan sayı ağırlıklı boyut ölçümlerine ulaşmasını sağlar. Yüksek çözünürlüklü, parçacıklar arası analiz, bu tekniği, yüksek oranda parçacık verimi10,12olan heterojen bir test örneğinde mevcut olduğunda aglomeraların veya daha büyük parçacıkların neden olduğu parazite daha az eğilimli hale getirir.
Ölçüm prosedürü, genellikle numune seyreltme gerektiren numunenin uygun bir süspansiyonunun hazırlanmasından ve ardından parçacıkların Brownian hareket davranışının video kaydından ve video analizinden oluşur. Numune odasından bir lazer ışını geçirilir ve lazer ışını yolundaki süspansiyon parçacıkları, monte edilmiş bir kamera ile optik mikroskop kullanarak görselleştirmelerine yol açan ışığı dağıtır. Kamera, Brownian hareketi altında hareket eden parçacıklardan dağınık lazer ışığının bir video dosyasını yakalar. Birçok parçacık, difüzyon katsayılarını belirlemek için ayrı ayrı izlenebilir ve hidrodinamik çapları Stokes-Einstein denklemi kullanılarak hesaplanabilir: d = kT/3πφD burada d hidrodinamik çap, k Boltzmann sabiti, T sıcaklıktır, η viskozite ve D difüzyon katsayısıdır10. NTA, genellikle kolloidal olarak kararsız olan parçacıkların toplama davranışını izlemek için de kullanılabilir (ancak parçacıklar ölçüm zaman ölçeği üzerinde kolloidal olarak kararlı olmalıdır)13,14. NTA mutlak bir yöntemdir ve bu çalışmada kullanılan cihaz üzerinde sistem kalibrasyonuna gerek yoktur. Kullanıcılar sistem performansını kontrol etmek istiyorlarsa, bu, boyut standart malzemelerin istedikleri sıklıklarda ölçülerek kolayca yapılabilir.
NTA aletinin hızlı analiz süresiyle (numune başına 10 dakikanın altında) kullanımı kolaydır. İyi veri tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği ile yüksek kaliteli ölçümler için, hem numune hazırlamada hem de alet çalışmasında bir dizi faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Bu faktörler dikkatle dikkate alınmazsa, farklı laboratuvarlarda ve operatörlerde aynı malzeme üzerinde yapılan ölçümler bilinmeyen veya düşük nicel belirsizliklere maruz kalabilir. NP karakterizasyonu sırasında, şirket içinde geliştirilen en iyi uygulamaları kullanmak, Roebben ve ark. tarafından DLS tekniği15için gösterildiği gibi, diğer laboratuvarlarla tutarlılığı her zaman garanti etmez.
Aslında, farklı laboratuvarlar, kullanıcılar ve enstrümanlar arasında erken (ilk tur) bir NTA ILC tutarsız sonuçlar ortaya çıkardı. Ana sorunlardan biri, düzenli hizmetleri veya kalibrasyon kontrolleri olmayan çeşitli eski eski aletlerin kullanımı ve yöntem yorumlamadaki farklılıklardı. Hole ve arkadaşları tarafından yapılan bir NTA ILC çalışması, bir sistemin nasıl kullanılacağı ve numunelerin nasıl hazırlanacağına dair paylaşılan yönergelerin olmamasıyla, laboratuvarlar arasında değişkenliğin nispeten monodispersed numuneler için bile büyük olabileceğini buldu16. Bu, ILC’nin ilk turundan elde edilen sonuçlarla birlikte, iyi enstrüman bakımının yanı sıra yöntem eğitimi ve iyi geliştirilmiş standart işletim prosedürlerine (SÇP’ ler) duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. İkincisi, iyi uygulamayla uyumluluğu tanımlamak ve belgelemek için güçlü bir araç olarak hareket eder. İyi ayrıntılıysa, standart işletim prosedürleri (SÇP’ler) netlik, açıklama, anlama, standardizasyon ve kalite güvencesi sunabilir.
Bir ILC çalışmasını benimsemek için öneri, bu nedenle, protokolleri hem geliştirmek hem de test etmek için idealdir16. ILC egzersizi bu spesifik NTA SOP’yi doğrulamak için harekete geçti ve bu nedenle bu spesifik nanomalzeme risk değerlendirme yöntemine güven ve netlik getirdi. Üç mermi içeriyordu. 1. raunt, eğitimden önce her katılımcının kendi enstrümanlarında 60 nm altın nanopartikül analiz etti. 2. raunt, cihazın doğru şekilde ayarlandığını ve kullanıcıların cihazın nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir bilgiye sahip olduğunu belirlemek için basit bir test olarak ortak yapılandırmaya sahip yeni bir enstrüman kullanarak 100 nm lateksi analiz etmeyi içeriyordu. 3. raunt, eğitimden sonra ortak konfigürasyona sahip yeni cihaz üzerindeki 60 nm altın nanopartiküllerin analizini içeriyordu. ILC’ye katılanlar, Horizon 2020 ACEnano projesinin tüm konsorsiyum üyeleri olan yedi farklı laboratuvardan geldi17.
Bu makalenin amacı, ayrıntılı eğitim ve SÇP geliştirmenin ardından yedi ortak tarafından 60 nm altın NPS’nin yeniden analiz edildiği NTA teknolojisi için üçüncü bir kıyaslama turunun yöntemini ve sonuçlarını tartışmaktır. ILC’nin ilk turunda elde edilen sonuçların karşılaştırılması ve referansı da yapılacaktır. ILC’nin 3. turundaki tüm analizler, 405 nm lazer ve yüksek hassasiyetli sCMOS kamera ile sağlanan aynı konfigürasyonun aynı cihazı (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirildi. Kıyaslama, teknolojinin numuneler üzerindeki performansını değerlendirir ve bu nedenle ‘en iyi uygulama’ protokollerinin geliştirilmesine yol açar. Bu nedenle, bu makale aynı zamanda bu ILC’de kullanılan enstrüman için NTA yöntemini, ICC’lerin uluslararası standartlara göre yürütülmesi ve değerlendirilmesi yoluyla uyumlu hale getirilmiş olduğu için bilim camiası için kullanılabilir hale getirmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Round 1 ILC’den elde edilen tutarsız sonuçlar, eski sistemler için cihaz sağlığı kontrollerinin yanı sıra daha ayrıntılı bir SÇP geliştirilmesi, uygulamalı eğitim ihtiyacı ve farklı laboratuvarlarda daha tutarlı sonuçlar elde etmek için ölçüm ve analiz ayarlarının daha iyi anlaşılması gerektiğini vurguladı. Aslında, Hole ve arkadaşları, bir NTA sisteminin nasıl kullanılacağı ve numunelerin nasıl hazırlanacağına dair paylaşılan yönergelerin bulunmamasının, nispeten monodispersed numuneler için bile laboratuvarlar arasında değişkenliğe neden olduğunu buldu16. Bu nedenle, tüm ILC katılımcıları, sistem çalışması ve ölçüm koşulları için en iyi uygulamaların yanı sıra belirli NTA cihazı için temizlik ve bakım kılavuzunu kapsayan bir eğitim atölyesine katıldı. Tüm katılımcılar ayrıca sonraki ILC turları için kendi laboratuvarlarında aynı cihaz üzerinde ölçümler yaptı. Prosedür ilk olarak, ortaklar tarafından altın ölçümlerini tekrarlamak için kullanılmadan önce lateks standart numuneler (ILC Round 2) üzerinde bir ILC çalıştırarak sistemi her laboratuvarda yerel olarak test eden bir turu içeriyordu (ILC Round 3). Bu altın örneklerin NTA ile ölçülmesinin amacı, nanogüvenlik kılavuz protokollerini etkilemek için gereken nanomalzeme risk değerlendirme yöntemlerine ve uygulamalarına güven ve netlik getirmekti.
NTA, parçacıkların hidrodinamik küresel eşdeğer çapını ölçebilen ve parçacık tarafından parçacık için kullanılabilen bir tekniktir, 10 nm – 50 nm arasında değişen polidispersed sistemlerin gerçek zamanlı görsel analizi, yaklaşık 1000 nm boyutuna (numune özelliklerine ve cihaz yapılandırmasına bağlı olarak). Minimum numune hazırlama gereklidir. Minimum numune hazırlığına rağmen, bu adım protokol için kritik öneme sahiptir ve bir numuneyi seyreltirken ve seyreltici seçerken büyük özen görünmelidir. Küresel eşdeğer boyut ölçümleri elde edildiği ve küresel olmayan parçacıklar daha az doğru boyut değerine sahip olacağı için şekil NTA açısından sınırlayıcı bir faktör olabilir.
NTA teknolojisi için, tüm numuneden yalnızca temsili bir örnek gözlendiği için her zaman bazı sonuç varyasyonları beklenmektedir. Ne olursa olsun, tüm sonuçlar parçacık boyutlandırma için ISO 19430 standardını karşılar. Sağlamak için en uygun konsantrasyon genellikle 30-60 saniyelik bir analiz süresi içinde 108 parçacık / ml civarındadır. Daha düşük parçacık konsantrasyonlarına sahip numuneler için, tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için daha uzun analiz süreleri gerekecektir. 109 parçacık/mL’den büyük bir parçacık konsantrasyonu içeren numuneler için, izleme sorunları olasılığı daha fazladır ve numunelerin NTA ölçümü için uygun bir aralığa kadar seyreltilmesi gerekecektir.
Genel olarak 3rd Yuvarlak ILC’den elde edilen sonuçlar, NTA ile altın nanopartikül ölçümlerinin daha fazla doğruluk ve tekrarlanabilirlik ile iyi tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Tüm NTA ölçümleri, yazılımdaki Otomatik Kurulum özelliği tarafından seçilen görüntüyü ayarlamak için otomatik kamera seviyesi ve netleme ayarları kullanılarak gerçekleştirildi. Yazılım tarafından belirlenen kamera seviyesi çok tutarlıydı, her durumda 10 veya 11 kamera seviyesi, beklendiği gibi, bir işlem ne kadar çok otomasyon içeriyorsa o kadar tutarlılık elde edildiğini gösteriyordu. Boyutlandırma sonuçları, sonuçların tekrarlanabilir olduğunu gösteren TEM vasıtası ile üretici tarafından elde edilenlerle karşılaştırılabilirdi, ancak TEM hidrodinamik çapı belirlemediği için farklı tekniklerden minimum fark beklenebilir. Sonuçların tutarlılığındaki önemli gelişme, cihaz bakımının, ayrıntılı SÇP’lerin, en iyi uygulama güncellemelerinin, kullanıcı bilgisinin ve NTA için uygulamalı ölçüm otomasyonunun önemini ve faydalarını göstermektedir. Sonuç olarak, ILC bu spesifik NTA SOP’yi doğruladı ve bu nedenle bu spesifik nanomalzeme risk değerlendirme yöntemine güven ve netlik getirdi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar H2020 tarafından finanse edilen projeden finansal destek kabul etmektedir: ACEnano (Hibe Anlaşması no 720952). Bu çalışma, Koreli ortakların Horizon 2020 ACEnano Projesi konsorsiyumuna katılımını sağlayan Kore Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı tarafından finanse edilen Uluslararası Kooperatif Ar-Ge Programı (N053100009 hibe numarası, “Horizon2020 AcEnano Toolbox’ta Kor-AB işbirliği ar-ge”) tarafından da kısmen desteklendi.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
References
- Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).
- Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. Transformations of nanomaterials in the environment. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Valsami-Jones, E., Lynch, I. How safe are nanomaterials. Science. 350 (6259), 388-389 (2015).
- Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona. Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).
- Hassellöv, M. a. R. K. . Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).
- Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. Nanoparticles and known and unknown health risks. Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).
- Briffa, S. M., et al. Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing. Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Walker, J. G. Improved nano-particle tracking analysis. Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).
- Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx (2019)
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Roebben, G., et al. Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment. Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).
- Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: https://cordis.europa.ue/project/id/720952 (2019)
- Soille, P., Vincent, L. . Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).
