Анализ слежения за наночастицами золота в Aqueous Media с помощью межлабораторного сравнения
Summary
Описанный здесь протокол направлен на измерение гидродинамического диаметра сферических наночастиц, в частности наночастиц золота, в aqueous media с помощью анализа слежения за наночастицами (NTA). Последнее включает в себя отслеживание движения частиц из-за броурианского движения и реализацию уравнения Стокса-Эйнштейна для получения гидродинамического диаметра.
Abstract
В области нанотехнологий аналитическая характеристика играет жизненно важную роль в понимании поведения и токсичности наноматериалов (НМ). Характеристика должна быть тщательной, а выбранная техника должна быть хорошо приспособлена к свойству, которое будет определено, анализируемому материалу и среде, в которой он присутствует. Кроме того, работа и методология инструмента должны быть хорошо разработаны и четко поняты пользователем, чтобы избежать ошибок в сборе данных. Любые расхождения в применяемом методе или процедуре могут привести к различиям и низкой воспроизводимости полученных данных. Целью настоящего документа является уточнение метода измерения гидродинамического диаметра наночастиц золота с помощью анализа слежения за наночастицами (NTA). Это исследование было проведено в качестве межлабораторного сравнения (ILC) среди семи различных лабораторий для проверки эффективности и воспроизводимости стандартной операционной процедуры. Результаты этого исследования ILC показывают важность и преимущества подробных стандартных операционных процедур (SOPs), обновлений наилучшей практики, знаний пользователей и автоматизации измерений.
Introduction
Наноматериалы (НМ) могут варьироваться как по физическим, так и по химическим характеристикам, которые, в свою очередь,влияют на их поведение,стабильность итоксичность 1, 2,3,4,5. Одной из основных трудностей при разработке глубокого понимания свойств, опасностей и поведения НМ является возможность получения воспроизводимой информации о физических и химических наноматериальных характеристиках. Примерами таких физических свойств являются размер частиц и распределение размеров6,7,8. Это важные параметры, поскольку они являются ключевым аспектом определения Европейской комиссией (ЕК) термина “нано”9.
Достижение точных измерений размера частиц также имеет решающее значение для многих различных промышленных и научно-исследовательских приложений и процессов в дополнение к пониманию судьбы итоксичности эффектовNMs 6,10. Важно иметь хорошо затученные методы, способные точно, надежно и воспроизводимо измерять размерЫ НМ. Кроме того, представленная информация должна обеспечить глубокое понимание используемого метода, например, указать тип параметра размера (например, фактический размер или гидродинамический размер), а также состояние выборки, например, конкретную среду, в которой присутствует НМ, и для надежного выполнения метода в различных средствах массовой информации. Для измерения размера можно использовать ряд методов, в том числе электронную микроскопию (EM), динамическое рассеяние света (DLS), индуктивно соединенную плазменную масс-спектрометрию (spICP-MS), дифференциальное центробежное осаждение (DCS), сканирующие микроскопию зонда (SPM), малоугольное рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и анализ наночастиц .
НТА является относительно новой технологией, которая была хорошо усовершенствована в последние годы и, как было доказано, надежно измеряет гидродинамический диаметр сферических НМ в сложных водных средствах массовой информации, таких, как системы, имеющие экологическое значение, например, пресноводные системы. Гидродинамический диаметр – это «размер гипотетической твердой сферы, которая рассеивается таким же образом, как и измеренная частица»11; в практическом плане и в водных средствах массовой информации это описывает диаметр больше, чем у самой частицы, которая также включает в себя слой молекул (в основном воды), удерживаемых на поверхности частицы слабыми электростатическими силами. Гидродинамический диаметр частицы будет меняться в различных средствах массовой информации, становится все меньше, как ионическая прочность средств массовой информации, в которых она измеряется становится выше.
Еще одной важной особенностью метода NTA является то, что он позволяет аналитику достичь взвешенных по численности измерений, которые необходимы в контексте наноматериального определения ЕС. Высокое разрешение, анализ частиц за частицами делает этот метод менее склонным к помехам, вызванным агломератами или более крупнымичастицами,когда они присутствуют в неоднородном тестовом образце с высокойскоростью пропускной способности частиц 10,12.
Процедура измерения состоит из подготовки подходящей подвески образца, которая часто требует разбавления образца, а затем видеозаписи поведения броунимского движения частиц и видеоанализа. Из камеры образца передается лазерный луч, а частицы подвески на пути лазерного луча рассеивают свет, что приводит к их визуализации с помощью оптического микроскопа с установленной камерой. Камера фиксирует видеофейл рассеянного лазерного света от частиц, движущихся под броурианским движением. Многие частицы могут быть отслежнены индивидуально, чтобы определить их коэффициенты диффузии и их гидродинамические диаметры могут быть рассчитаны с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна: d q kT/3 ‘D, где d является гидродинамическим диаметром, k является константой Boltzmann, T является температура, η является вязкость и D является диффузионныйкоэффициент 10. NTA также может быть использован для отслеживания агрегации поведение частиц, которые, как правило, коллоидно нестабильны (частицы должны, однако, быть коллоидно стабильной по шкалевремени измерения) 13,14. NTA является абсолютным методом, и на инструменте, используемом в этой работе, не требуется калибровка системы. Если пользователи хотят проверить производительность системы, это можно легко сделать, измеряя размер стандартных материалов так часто, как хотелось бы.
Инструмент NTA прост в эксплуатации с временем быстрого анализа (менее 10 минут на образец). Для высококачественных измерений с хорошей повторяемостью и воспроизводимостью данных следует учитывать ряд факторов как при подготовке выборки, так и при эксплуатации приборов. Если такие факторы не будут тщательно рассмотрены, измерения одного и того же материала в различных лабораториях и операторах могут подвергаться неизвестной или плохо количественной неопределенности. Во время характеристики NP использование наилучшей практики в разработанных SOPs не всегда гарантирует согласованность с другими лабораториями, как показано Roebben et al. для метода DLS15.
В самом деле, ранний (первый раунд) NTA ILC между различными лабораториями, пользователями и инструментами показали несовместимые результаты. Одна из основных проблем заключается в использовании различных старых устаревших инструментов, которые не имели регулярных услуг или проверок калибровки, а также различиях в толковании методов. Исследование NTA ILC, проведенное Hole et al., показало, что при отсутствии общих руководящих принципов по использованию системы и подготовке образцов изменчивость лабораторий может быть большой даже для относительно монодисперсныхобразцов 16. Это наряду с результатами первого раунда ILC подчеркивает необходимость хорошего обслуживания приборов, а также подготовки методов и хорошо разработанных стандартных операционных процедур (SOPs). Последние выступают в качестве мощного инструмента для описания и документирования соблюдения практической практики. При достаточно детальном анализе стандартные операционные процедуры (SOPs) могут обеспечить ясность, разъяснение, понимание, стандартизацию и гарантию качества.
Поэтому рекомендация о принятии исследования ILC идеально подходит как для разработки, так и для тестирования протоколов16. Упражнение ILC приняло меры для проверки этого конкретного NTA SOP и, следовательно, ввело уверенность и ясность в этот конкретный метод оценки наноматериального риска. Она включала в себя три раунда. Раунд 1 проанализировал 60 нм золотых наночастиц на собственных инструментах каждого участника перед тренировкой. Раунд 2 включало анализ латекса 100 нм с использованием нового инструмента с общей конфигурацией в качестве простого теста, чтобы определить, что инструмент был настроен правильно и пользователи имели хорошие знания о том, как использовать инструмент. Раунд 3 включало анализ 60 нм золотых наночастиц на новом инструменте с общей конфигурацией, после тренировки. Участники ILC пришли из семи различных лабораторий, все члены консорциума Horizon 2020 ACEnano проекта17.
Целью данной статьи является обсуждение метода и результатов третьего раунда бенчмаркинга для технологии NTA, где 60 нм золота NPs были повторно проанализированы семью партнерами после детального обучения и разработки SOP. Будет также сделано сравнение и ссылка на результаты, полученные в первом туре КМП. Все анализы, проведенные в третьем раунде ILC, проводились с использованием одного и того же инструмента (см. таблицу материалов)идентичной конфигурации, оснащенной лазером 405 нм и камерой высокой чувствительности sCMOS. Бенчмаркинг оценивает эффективность технологии по образцам и, следовательно, приводит к разработке протоколов “наилучшей практики”. Таким образом, эта статья также разделяет и делает метод NTA для инструмента, используемого в этом ILC, доступным для научного сообщества, поскольку он был согласован путем проведения и оценки ILCs в соответствии с международными стандартами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Противоречивые результаты, полученные в ходе ILC Первого раунда, подчеркнули необходимость проверки состояния здоровья приборов для старых систем, а также разработку более подробного SOP, необходимость практической подготовки и лучшего понимания параметров измерения и анализа, с тем чтобы обеспечить более последовательные результаты в различных лабораториях. В самом деле, Hole et al. обнаружили, что отсутствие общих руководящих принципов о том, как использовать систему NTA и подготовить образцы привело к изменчивости между лабораториями даже для относительно монодисперсных образцов16. Поэтому все участники КМП приняли участие в учебном семинаре, охватывав передовой опыт работы системы и условия измерения, а также руководство по очистке и техническому обслуживанию конкретного инструмента НТА. Все участники также проводили измерения на одном и том же приборе в своих лабораториях для последующих раундов ILC. Процедура сначала включала раунд, который тестировал систему локально в каждой лаборатории, запуская ILC на латексных стандартных образцах (ILC Round 2), прежде чем использоваться партнерами для повторения измерений золота (ILC Round 3). Цель измерения этих образцов золота с помощью НТА состояла в том, чтобы внести уверенность и ясность в методы и практику оценки наноматериальных рисков, необходимые для воздействия на протоколы руководства по нанобезопасности.
NTA является методом, который может измерять гидродинамический сферический эквивалентный диаметр частиц и может быть использован для частиц частицы, в режиме реального времени визуальный анализ полидисперсных систем в диапазоне от 10 нм – 50 нм, примерно 1000 нм в размере (в зависимости от свойств образца и конфигурации инструмента). Требуется минимальная подготовка образца. Несмотря на минимальную подготовку образца, этот шаг имеет решающее значение для протокола и большой осторожностью следует принимать при разбавлении образца и выборе разбавления. Форма может быть ограничивающим фактором по отношению к NTA, как сферические эквивалентные измерения размера получены и несферические частицы будут иметь менее точное значение размера.
Что касается технологии НТА, то всегда следует ожидать некоторых изменений в результатах, поскольку из всей выборки наблюдается только репрезентативная выборка. Несмотря на это, все результаты соответствуют стандарту ISO 19430 для размера частиц. Оптимальная концентрация, как правило, около 108 частиц / мл в течение 30-60 секунд анализа времени. Для образцов с более низкими концентрациями частиц для обеспечения воспроизводимых результатов потребуется более длительное время анализа. Для образцов, содержащих концентрацию частиц, более 109 частиц/мл, существует большая вероятность отслеживания проблем, и образцы необходимо будет разбавить до подходящего диапазона для измерения NTA.
В целом результаты 3-гораунда ILC показывают хорошую воспроизводимость измерений наночастиц золота с NTA с повышенной точностью и повторяемостью. Все измерения NTA проводились с использованием параметров автоматического уровня камеры и фокусировки для настройки изображения, выбранного функцией Auto-Setup в программном обеспечении. Уровень камеры, установленный программным обеспечением, был очень последовательным, при этом уровень камеры 10 или 11 устанавливаемый во всех случаях, показывающий, что, как и ожидалось, чем больше автоматизации процесс включает в себя, тем больше согласованности достигается. Результаты размеров были сопоставимы с результатами, полученными производителем с помощью TEM, что указывает на то, что результаты были воспроизводимыми, однако минимальные различия следует ожидать от различных методов, поскольку TEM не определяет гидродинамический диаметр. Значительное улучшение согласованности результатов показывает важность и преимущества технического обслуживания приборов, подробных SOPs, обновлений наилучшей практики, знаний пользователей и прикладной автоматизации измерений для NTA. В заключение ILC подтвердил этот конкретный NTA SOP и, следовательно, внес уверенность и ясность в этот конкретный метод оценки наноматериального риска.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают финансовую поддержку проекта, финансируемого H2020: ACEnano (Грантово соглашение No 720952). Эта работа была также частично поддержана Международной программой сотрудничества в области НИОКР, финансируемой Министерством торговли, промышленности и энергетики Кореи (номер гранта N053100009, “Horizon2020 Kor-EU совместных НИОКР на ACEnano Toolbox”), что позволило участие корейских партнеров в консорциуме Horizon 2020 ACEnano проекта.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
References
- Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).
- Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. Transformations of nanomaterials in the environment. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Valsami-Jones, E., Lynch, I. How safe are nanomaterials. Science. 350 (6259), 388-389 (2015).
- Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona. Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).
- Hassellöv, M. a. R. K. . Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).
- Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. Nanoparticles and known and unknown health risks. Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).
- Briffa, S. M., et al. Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing. Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Walker, J. G. Improved nano-particle tracking analysis. Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).
- Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx (2019)
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Roebben, G., et al. Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment. Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).
- Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: https://cordis.europa.ue/project/id/720952 (2019)
- Soille, P., Vincent, L. . Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).
