Nanopartikel-Tracking-Analyse von Gold-Nanopartikeln in wässrigen Medien durch einen interlaborativen Vergleich
Summary
Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den hydrodynamischen Durchmesser sphärischer Nanopartikel, genauer gesagt Gold-Nanopartikel, in wässrigen Medien mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zu messen. Letzteres beinhaltet die Verfolgung der Bewegung von Teilchen aufgrund der Brownschen Bewegung und die Implementierung der Stokes-Einstein-Gleichung, um den hydrodynamischen Durchmesser zu erhalten.
Abstract
Im Bereich der Nanotechnologie spielt die analytische Charakterisierung eine entscheidende Rolle beim Verständnis des Verhaltens und der Toxizität von Nanomaterialien (NMs). Die Charakterisierung muss gründlich sein, und die gewählte Technik sollte gut für die zu bestimmende Eigenschaft, das zu analysierende Material und das Medium, in dem sie vorhanden ist, geeignet sein. Darüber hinaus müssen die Funktionsweise und Methodik des Instruments gut entwickelt und vom Benutzer klar verstanden werden, um Fehler bei der Datenerfassung zu vermeiden. Abweichungen in der angewandten Methode oder Vorgehensweise können zu Unterschieden und einer schlechten Reproduzierbarkeit der erhaltenen Daten führen. Dieses Papier zielt darauf ab, die Methode zur Messung des hydrodynamischen Durchmessers von Gold-Nanopartikeln mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zu klären. Diese Studie wurde als Laborvergleich (ILC) zwischen sieben verschiedenen Laboratorien durchgeführt, um die Leistung und Reproduzierbarkeit des Standardbetriebsverfahrens zu validieren. Die Ergebnisse dieser ILC-Studie zeigen die Bedeutung und den Nutzen detaillierter Standard-Betriebsverfahren (SOPs), Best Practice-Updates, Benutzerwissen und Messautomatisierung.
Introduction
Nanomaterialien (NMs) können sowohl in physikalischen als auch in chemischen Eigenschaften variieren, die wiederum ihr Verhalten, ihre Stabilität und ihre Toxizität beeinflussen1,2,3,4,5. Eine der größten Schwierigkeiten bei der Entwicklung eines gründlichen Verständnisses der NM-Eigenschaften, -Gefahren und -Verhaltensweisen ist die Fähigkeit, reproduzierbare Informationen über physikalische und chemische Nanomaterialeigenschaften zu erhalten. Beispiele für solche physikalischen Eigenschaften sind Partikelgröße und Größenverteilung6,7,8. Dies sind wichtige Parameter, da sie ein Schlüsselaspekt der Definition des Begriffs “Nano”9durch die Europäische Kommission (EG) sind.
Die Erzielung präziser Partikelgrößenmessungen ist auch für viele verschiedene Industrie- und Forschungsanwendungen und -prozesse von entscheidender Bedeutung, zusätzlich zum Verständnis der Schicksals- und Toxizitätseffekte von NMs6,10. Es ist wichtig, über gut etablierte Methoden zu verfügen, die in der Lage sind, die Größe von NMs genau, zuverlässig und reproduzierbar zu messen. Darüber hinaus sollten die gemeldeten Informationen ein tiefes Verständnis der verwendeten Technik vermitteln, z. B. die Art des Größenparameters (z. B. tatsächliche Größe oder hydrodynamische Größe) sowie die Probenbedingung, z. B. das spezifische Medium, in dem das NM vorhanden ist, und für die Methode, die in verschiedenen Medien zuverlässig funktioniert. Um die Größe zu messen, können eine Reihe von Techniken eingesetzt werden, darunter Elektronenmikroskopie (EM), dynamische Lichtstreuung (DLS), einzelne partikelinduktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie (spICP-MS), Differentialzentrifugalsedimentation (DCS), Scan-Sondenmikroskopie (SPM), Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA).
NTA ist eine relativ neue Technologie, die in den letzten Jahren weit fortgeschritten ist und nachweislich den hydrodynamischen Durchmesser sphärischer NMs in komplexen wässrigen Medien, wie z. B. Mit Umweltrelevanz, z. B. Süßwassersystemen, zuverlässig misst. Der hydrodynamische Durchmesser ist “die Größe einer hypothetischen harten Kugel, die auf die gleiche Weise diffundiert wie die des zu messenden Teilchens”11; in der Praxis und in wässrigen Medien beschreibt dies einen Durchmesser, der größer ist als der des Teilchens selbst, der auch eine Schicht von Molekülen (meist Wasser) umfasst, die durch schwache elektrostatische Kräfte an der Oberfläche des Teilchens gehalten werden. Der hydrodynamische Durchmesser eines Teilchens variiert in verschiedenen Medien und wird kleiner, wenn die Ionenstärke der Medien, in denen es gemessen wird, höher wird.
Ein weiteres wichtiges Merkmal der NTA-Technik ist, dass sie es dem Analytiker ermöglicht, zahlengewichtete Größenmessungen zu erreichen, die im Rahmen der EG-Nanomaterialdefinition erforderlich sind. Die analyse mit hoher Auflösung, Partikel für Partikel, macht diese Technik weniger anfällig für Interferenzen, die durch Agglomerate oder größere Partikel verursacht werden, wenn sie in einer heterogenen Testprobe mit einer hohen Partikeldurchsatzrate10,12vorhanden sind.
Das Messverfahren besteht in der Vorbereitung einer geeigneten Suspension der Probe, die oft eine Verdünnung der Probe erfordert, gefolgt von einer Videoaufzeichnung des Brownschen Bewegungsverhaltens der Teilchen und einer Videoanalyse. Aus der Probenkammer wird ein Laserstrahl übergeben und die Suspensionspartikel im Pfad des Laserstrahls streuen Licht, was zu ihrer Visualisierung mit einem optischen Mikroskop mit montierter Kamera führt. Die Kamera erfasst eine Videodatei des gestreuten Laserlichts von den Partikeln, die sich unter Brownian-Bewegung bewegen. Viele Teilchen können einzeln verfolgt werden, um ihre Diffusionskoeffizienten zu bestimmen, und ihre hydrodynamischen Durchmesser können mit der Stokes-Einstein-Gleichung berechnet werden: d = kT/3-D, wobei d der hydrodynamische Durchmesser ist, k ist die Boltzmann-Konstante, T ist die Temperatur, η ist die Viskosität und D ist der Diffusionskoeffizient10. NTA kann auch verwendet werden, um das Aggregationsverhalten von Partikeln zu verfolgen, die im Allgemeinen umgangssprachlich instabil sind (die Partikel müssen jedoch über die Messzeitskala hinweg kolloidal stabil sein)13,14. NTA ist eine absolute Methode und es ist keine Systemkalibrierung auf dem bei dieser Arbeit verwendeten Gerät erforderlich. Wenn Anwender die Systemleistung überprüfen möchten, kann dies einfach durch die Messung von Größenstandardmaterialien so häufig wie gewünscht erfolgen.
Das NTA-Instrument ist mit schneller Analysezeit (unter 10 min pro Probe) einfach zu bedienen. Bei qualitativ hochwertigen Messungen mit guter Datenwiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit sollten sowohl bei der Probenvorbereitung als auch im Gerätebetrieb eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden. Wenn solche Faktoren nicht sorgfältig berücksichtigt werden, können Messungen an demselben Material in verschiedenen Laboratorien und Betreibern unbekannten oder schlecht quantifizierten Unsicherheiten unterliegen. Während der NP-Charakterisierung garantiert die Verwendung von Best Practices im eigenen Haus entwickelte SOPs nicht immer die Konsistenz mit anderen Laboratorien, wie Roebben et al. für die DLS-Technik15zeigen.
Tatsächlich zeigte eine frühe (erste Runde) NTA ILC zwischen verschiedenen Laboratorien, Anwendern und Instrumenten inkonsistente Ergebnisse. Eines der Hauptprobleme war die Verwendung verschiedener älterer Altinstrumente, die keine regelmäßigen Dienste oder Kalibrierungsprüfungen hatten, sowie Unterschiede in der Methodeninterpretation. Eine NTA ILC-Studie von Hole et al. fand heraus, dass die Variabilität zwischen Laboratorien auch bei relativ monodispersenProbengroß sein kann, da keine gemeinsamen Richtlinien für die Verwendung eines Systems und die Vorbereitung von Proben bestehen. Dies und die Ergebnisse der ersten Runde des ILC unterstreichen die Notwendigkeit einer guten Instrumentenwartung sowie Methodenschulungen und gut entwickelter Standardbetriebsverfahren (SOPs). Letztere dienen als ein leistungsfähiges Instrument, um die Einhaltung bewährter Verfahren zu beschreiben und zu dokumentieren. Bei detaillierten Angaben können Standard-Betriebsverfahren (SOPs) Klarheit, Erklärung, Verständnis, Standardisierung und Qualitätssicherung bieten.
Die Empfehlung für die Annahme einer ILC-Studie ist daher ideal für die Entwicklung und Prüfung von Protokollen16. Die ILC-Übung wirkte, um dieses spezifische NTA-SOP zu validieren und brachte somit Vertrauen und Klarheit in diese spezifische Nanomaterial-Risikobewertungsmethode ein. Es handelte sich um drei Runden. Runde 1 analysierte 60 nm Gold-Nanopartikel auf den eigenen Instrumenten jedes Teilnehmers vor dem Training. Runde 2 beinhaltete die Analyse von 100 nm Latex mit einem neuen Instrument mit gemeinsamer Konfiguration als einfachen Test, um festzustellen, ob das Instrument richtig eingerichtet war und die Benutzer gute Kenntnisse über die Verwendung des Instruments hatten. Runde 3 umfasste die Analyse von 60 nm Gold-Nanopartikeln am neuen Instrument mit gemeinsamer Konfiguration nach dem Training. Die Teilnehmer an der ILC kamen aus sieben verschiedenen Labors, alle Konsortiumsmitglieder des Horizon 2020 ACEnano Projekts17.
Ziel dieses Artikels ist es, die Methode und die Ergebnisse einer dritten Benchmarking-Runde für die NTA-Technologie zu diskutieren, bei der 60 nm Gold-NPs von sieben Partnern nach eingehender Schulung und SOP-Entwicklung neu analysiert wurden. Es werden auch Vergleiche und Verweise auf die Ergebnisse der ersten Runde des ILC vorgenommen. Alle Analysen aus Runde 3 von ILC wurden mit demselben Instrument (siehe Materialtabelle) mit identischer Konfiguration durchgeführt, die mit einem 405 nm Laser und einer hochempfindlichen sCMOS-Kamera geliefert wurde. Benchmarking bewertet die Leistung der Technologie auf Proben und führt daher zur Entwicklung von “Best-Practice”-Protokollen. So teilt und stellt dieser Artikel auch die NTA-Methode für das in diesem ILC verwendete Instrument für die wissenschaftliche Gemeinschaft zur Verfügung, da sie durch die Durchführung und Bewertung der ILCC nach internationalen Standards harmonisiert wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die inkonsistenten Ergebnisse der 1. Runde des ILC zeigten die Notwendigkeit von Instrumentenzustandsprüfungen für ältere Systeme sowie die Entwicklung eines detaillierteren SOP, die Notwendigkeit einer praktischen Schulung und ein besseres Verständnis der Mess- und Analyseeinstellungen, um konsistentere Ergebnisse in den verschiedenen Labors zu gewährleisten. Tatsächlich stellten Hole et al. fest, dass das Fehlen gemeinsamer Leitlinien für die Verwendung eines NTA-Systems und die Vorbereitung von Proben selbst bei relativ monodispersen Proben zu einer Variabilität zwischen Laboratorien führte16. Daher nahmen alle ILC-Teilnehmer an einem Schulungsworkshop teil, der die Best Practices für den Systembetrieb und die Messbedingungen sowie die Reinigungs- und Wartungsberatung für das spezifische NTA-Instrument umfasste. Alle Teilnehmer führten auch Messungen am selben Instrument in ihren eigenen Laboren für die nachfolgenden ILC-Runden durch. Das Verfahren umfasste zunächst eine Runde, in der das System lokal in jedem Labor getestet wurde, indem ein ILC auf Latex-Standardproben (ILC Round 2) ausgeführt wurde, bevor es von den Partnern zur Wiederholung der Goldmessungen verwendet wurde (ILC Round 3). Ziel der Messung dieser Goldproben mit Hilfe von NTA war es, Vertrauen und Klarheit in die Methoden und Verfahren zur Risikobewertung von Nanomaterial zu bringen, die erforderlich sind, um die Leitlinien für die Nanosicherheit zu beeinflussen.
NTA ist eine Technik, die den hydrodynamischen kugelförmigen Äquivalentdurchmesser von Partikeln messen kann und für Partikel nach Partikeln, visuelle Echtzeitanalysen von polydispergierten Systemen von 10 nm – 50 nm bis zu einer Größe von ca. 1000 nm (abhängig von den Probeneigenschaften und der Instrumentenkonfiguration) verwendet werden kann. Eine minimale Probenvorbereitung ist erforderlich. Trotz minimaler Probenvorbereitung ist dieser Schritt entscheidend für das Protokoll und es sollte bei der Verdünnung einer Probe und der Wahl eines Verdünnungsmittels große Vorsicht walten. Die Form kann ein begrenzender Faktor in Bezug auf NTA sein, da kugelförmige Äquivalentgrößenmessungen erhalten werden und nicht-sphärische Partikel einen weniger genauen Größenwert aufweisen.
Bei der NTA-Technologie ist immer mit einer gewissen Ergebnisvariation zu rechnen, da nur eine repräsentative Stichprobe aus der gesamten Stichprobe beobachtet wird. Unabhängig davon erfüllen alle Ergebnisse den ISO 19430-Standard für die Partikelgrößen). Die optimale Konzentration liegt in der Regel bei etwa 108 Partikeln/ml innerhalb einer 30-60-Sekunden-Analysezeit. Für Proben mit niedrigeren Partikelkonzentrationen sind längere Analysezeiten erforderlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Bei Proben mit einer Konzentration von Partikeln von mehr als 109 Partikeln/ml ist die Wahrscheinlichkeit, Probleme zu verfolgen, größer, und Proben müssen bis zu einem geeigneten Bereich für Die NTA-Messung verdünnt werden.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse der3. Runde ILC eine gute Reproduzierbarkeit von Gold-Nanopartikelmessungen mit NTA mit erhöhter Genauigkeit und Wiederholbarkeit. Alle NTA-Messungen wurden mit den automatischen Kamerapegel- und Fokuseinstellungen durchgeführt, um das Bild anzupassen, wie es durch die Auto-Setup-Funktion in der Software ausgewählt wurde. Der von der Software festgelegte Kamerapegel war sehr konsistent, wobei in allen Fällen eine Kamerastufe von 10 oder 11 eingestellt wurde, die zeigt, dass wie erwartet, je mehr Automatisierung ein Prozess beinhaltet, desto mehr Konsistenz erreicht wird. Die Größenangaben waren vergleichbar mit denen des Herstellers mittels TEM, was darauf hindeutet, dass die Ergebnisse reproduzierbar waren, jedoch sind von verschiedenen Techniken minimale Unterschiede zu erwarten, da TEM den hydrodynamischen Durchmesser nicht bestimmt. Die signifikante Verbesserung der Konsistenz der Ergebnisse zeigt die Bedeutung und die Vorteile der Gerätewartung, detaillierter SOPs, Best Practice-Updates, Benutzerwissen und angewandter Messautomatisierung für NTA. Abschließend bestätigte die ILC dieses spezifische NTA-SOP und brachte damit Vertrauen und Klarheit in diese spezifische Nanomaterial-Risikobewertungsmethode ein.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung aus dem von H2020 geförderten Projekt ACEnano (Grant Agreement No 720952). Diese Arbeit wurde teilweise auch durch das vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie Koreas finanzierte Internationale Kooperative S&E-Programm (Grant-Nummer N053100009, “Horizon2020 Kor-EU kollaborative R&BD on ACEnano Toolbox”) unterstützt, das die Teilnahme der koreanischen Partner am Konsortium des Horizon 2020 ACEnano-Projekts ermöglichte.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
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